Nature子刊：中山大学杨建华/李斌/屈良鹄团队介绍全长非帽RNA测序技术NAP-seq的原理及实验步骤

摘要：ENCODE 计划揭示了人类基因组超过 80% 的基因组区域能够转录产生“暗物质”之称的 RNA。根据 RNA 的 5' 端是否具有帽子修饰结构，这些可以被分为两大类：1）帽子结构的（capped RNA，capRNA）；2）非帽 RNA（noncapped

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

ENCODE 计划揭示了人类基因组超过 80% 的基因组区域能够转录产生“暗物质”之称的 RNA。根据 RNA 的 5' 端是否具有帽子修饰结构，这些可以被分为两大类：1）帽子结构的（capped RNA，capRNA）；2）非帽 RNA（noncapped RNA，napRNA）。除 mRNA 和部分长非编码外，其余几乎所有均属于 napRNA。

这些 napRNA 不仅通过作为非编码 RNA（ncRNA）调控多种生物学过程，还作为加工产物解析特定的 RNA 生物生成过程。然而，由于其长度异质性、末端修饰多样性以及复杂的二级结构等，鉴定这些 napRNA 面临巨大挑战。

为应对这一挑战，中山大学生命科学学院杨建华/李斌/屈良鹄教授团队开发了NAP-seq技术，并于 2025 年 9 月 17 日在Nature Protocols期刊发表了题为：NAP-seq for full-length noncapped RNA sequencing 的论文，系统介绍了该方法的设计原理与实验步骤。

图1. NAP-seq的设计原理和实验步骤

NAP-seq 技术具有以下显著优势（图2）：

1）大规模新发现：在人类和小鼠中，分别鉴定出超过 16000 条和 9500 条新的 napRNA，展现出远超传统方法的发现能力。

2）单核苷酸分辨率的全面 napRNA 分析: 定制化接头序列能够同时捕获 napRNA 的两端，从而在单核苷酸分辨率下解析全长序列，并发现具有特征性末端基序和结构元件的 napRNA。

3）高效检测修饰 RNA 与复杂结构 RNA：T4 PNK 和 SuperScript IV 逆转录酶的使用，使 NAP-seq 能够检测多种 RNA 修饰和高度稳定的二级结构RNA。

4）富集低丰度 napRNA：通过基于 RNase H 的去除策略，有效去除高丰度的 rRNA、snoRNA 及其他 ncRNA，去除效率可达 99.9%，从而显著提升低表达 napRNA 的发现率。

5）确保全长 cDNA 合成：巢式逆转录引物设计保证了长链 napRNA 的全长 cDNA 扩增，并最大程度减少错误引物引发的伪影。

6）拓展 napRNA 家族的检测范围: 在建库前设置的片段大小选择（≥100 nt），使 NAP-seq 能够识别数千条被传统小 RNA 测序忽略的长 napRNA（≥100 nt），包括 C/D box RNA、H/ACA box RNA 以及 Pol III 转录 RNA 的新亚类，序列长度可达约 2000 nt。

7) 精确定量与减少偏倚：在接头中引入条形码，有助于消除 PCR 扩增偏倚，并减少因末端连接效率差异导致的序列特异性偏差，实现对 napRNA 的更精准定量。

8) 双平台整合：NAP-seq 结合 Oxford Nanopore 测序（NAP-seq-TGS）与 Illumina 测序（NAP-seq-NGS）的优势，前者实现实时、直接的全长分子分析，后者提供碱基水平的高精度短读长序列。研究人员可根据不同研究需求独立或联合使用两类技术，获得更全面的 napRNA 特征信息。

9) 高效利用样本：相较于 TERA-seq 等全长 RNA 测序方法至少需 75 μg RNA，且仅限 ONT 平台，NAP-seq 仅需 1 μg RNA 即可完成建库，极大拓展了其在有限样本研究中的适用性。

10) 流程化的计算机分析：配套开发 cutAdapter、napSeeker 等软件与分析流程，能够快速发现并注释多类型 napRNA。