摘要：1939年夏天，对许多人而言，是去海滩休闲、探访亲友或在国家公园徒步的好时机。而阿尔伯特·库恩斯（Albert Coons）却将时间花在了观察尸检上，思考着白血病以及当时细菌感染的常见并发症——风湿热等疾病。此时，这位27岁的年轻人刚在马萨诸塞州总医院完成了为

导读

Mitchell Leslie | 撰文

齐 萱 | 翻译

1939年夏天，对许多人而言，是去海滩休闲、探访亲友或在国家公园徒步的好时机。而阿尔伯特·库恩斯（Albert Coons）却将时间花在了观察尸检上，思考着白血病以及当时细菌感染的常见并发症——风湿热等疾病。

此时，这位27岁的年轻人刚在马萨诸塞州总医院完成了为期两年的实习医师工作，正等待前往波士顿市立医院担任助理住院医师。

六个月的假期结束后，他前往柏林，他有一位朋友在当地的一家医院担任病理学家。两人经常聚在一起探讨科学和医学问题。库恩斯回忆说，他还将很多时间用于“阅读或沉思”。有一天，他开始思索风湿热患者心脏中生长的微小结节。医生们怀疑，当一种未知的细菌分子引发免疫反应时，这些结节就会形成。然而，要验证这一假设，他们需要确认引发反应的分子（即抗原）是否隐藏在病变组织中。库恩斯在医学培训期间研究过抗体，他灵机一动，想到可以用一种带有彩色分子的抗体来标记抗原。

原发性免疫荧光的基本概念示意图

库恩斯将这个想法告诉了他的病理学家朋友，但朋友对此不以为然。“我觉得他认为这不可行，”库恩斯回忆道。然而，这一灵感催生了一种名为免疫荧光的技术，该技术后来成为诊断和研究的主要支柱，当时在哈佛医学院的库恩斯也因此获得了1959年的阿尔伯特·拉斯克基础医学研究奖。

免疫荧光技术涉及将荧光化合物附着在抗体上，从而创建出分子定位信标。抗体与抗原（通常是一种蛋白质）结合，并发出信号，表明其在细胞、组织或器官中的存在。“我们每天都在实验室使用这项技术，”密歇根大学医学院免疫组织学实验室的技术总监史蒂文·赫里卡伊（Steven Hrycaj）说道，该实验室每年分析约15万份患者样本。“它挽救了生命。”

赫里卡伊表示，免疫荧光技术的基本原理几乎没有改变。“库恩斯所做的几乎与我们如今所做的完全一样。”但近年来，研究人员也为这项技术开发了新的应用，并拓展了其功能。例如，外科医生已利用免疫荧光技术来界定肿瘤的边界，使其更易于切除。

现在免疫荧光技术不再局限于单一颜色，而是提供了一系列颜色选择，从而能够检测多种蛋白质。“我们可以在单个样本上检测60种不同的抗体，”匹兹堡大学的外科病理学家阿图尔·辛吉（Aatur Singhi）说道。科学家们也正在努力开发库恩斯这一创意的更多用途。

神经母细胞瘤培养细胞的免疫荧光显微照片。荧光染料突出显示细胞核中的蛋白质（黄色）以及细胞骨架蛋白丝、微管蛋白（绿色）和肌动蛋白（蓝色）

库恩斯称，他的这一见解“再明显不过了”。但斯坦福大学的免疫学家休·麦克德维特（Hugh McDevitt）曾撰写一篇对库恩斯职业生涯的赞赏文章，他表示，库恩斯低估了自己的成就。考虑到1939年科学家们对抗体了解甚少，“在抗体分子上添加可见标记的概念似乎既大胆又新颖。”

然而，将这一概念转化为实用的实验室技术却并非易事，库恩斯在1939年晚些时候回到美国后便深有体会。一方面，他的临床工作占据了他大部分时间。库恩斯偶尔进入实验室时，他尝试将彩色分子与抗体结合的努力都失败了。在获得一个研究奖学金、摆脱临床工作后，他才开始取得进展。库恩斯成功地将彩色分子附着在抗体上，并用它们来标记细菌。但结果令人失望，因为“在显微镜下，这些生物体只是呈现出淡淡的粉红色，”他回忆道，“用这种强度的颜色，根本无法在组织中找到少量的抗原。”

为了增强抗体的荧光效果，库恩斯联系了哈佛大学的一位有机化学家，后者建议他“‘下楼去和地下室里的两位研究人员谈谈，他们已经在将荧光化合物与蛋白质结合了。’”库恩斯与这两位研究人员合作，将一种在紫外光下发出蓝色荧光的分子附着在能识别某些细菌表面抗原的抗体上。当科学家们将标记的抗体添加到细菌样本中时，这些微生物“在紫外光下呈现出明亮的荧光，”库恩斯写道。1941年的一篇论文介绍了他们的研究成果。

但这只是第一步，库恩斯希望能在患者样本中检测抗原。然而，在紫外光下，组织自然会产生一种蓝色荧光，掩盖了标记抗体的信号。为了解决这个问题，他和同事们换用了一种新的标记物——一种能发出绿色荧光的化合物，这种化合物能在人体自然的蓝色背景下脱颖而出。他们还请来了一位哈佛大学的化学专业研究生来合成这种化合物。在给抗体装备上这种分子后，研究人员表明，他们能够在小鼠组织中定位细菌。

当他们取得这一突破时，美国已卷入了第二次世界大战。库恩斯很快以医生的身份加入了军队。他在横跨全国的火车上撰写了描述团队研究成果的论文，以便能够前往南太平洋执行任务。一位同事将论文提交给了一家期刊，但库恩斯承认，直到1943年，当期刊的副本“在澳大利亚布里斯班送到我手中时，我正准备登船前往北部的巴布亚新几内亚”，他才得知论文的发表情况。

库恩斯在美国陆军担任了四年的病理学家和医院实验室服务主任。1946年回到哈佛后，他希望继续开展免疫荧光技术的研究。之前实验的试剂仍存放在校园的冰箱里，但由于他的化学同事都不愿意制作他所需的荧光标记物，他不得不自己学习合成。库恩斯与不同的研究人员合作，对这项技术进行了微调，并在1950年和1951年发表的研究中展示了其威力。例如，团队表明，免疫荧光技术可以检测小鼠体内的病毒。库恩斯很快转而研究人体如何产生抗体。

成纤维细胞的免疫荧光显微照片；细胞核呈紫色，微管呈红色

最近的进展提高了免疫荧光技术的诊断价值。库恩斯和他的同事们一次只能检测一种抗原。一种名为多重免疫荧光的新技术于过去十年间问世，它可以使用不同的抗体同时定位多种抗原，每种抗体都带有独特的颜色。辛吉表示，这种能力对患者来说非常重要，因为病理学家可以从小的组织样本中提取更多信息。“免疫荧光的未来在于多重检测，”他说道。

出于与临床医生相同的许多原因，科学家们也在工作中采用了免疫荧光技术。“在研究中，它是标准方法，”赫里卡伊说道。这项技术之所以具有启发性，是因为它可以确定特定蛋白质的位置、数量以及它们之间的相互作用——这些信息对于细胞生物学家、神经科学家、免疫学家、癌症生物学家和其他研究人员来说至关重要。与二维的免疫组织化学不同，免疫荧光技术可以使研究人员在三维空间中分析蛋白质的分布，从而更清晰地了解组织的结构和功能。

范德比尔特大学医学中心的埃本·罗森塔尔（Eben Rosenthal）等研究人员为免疫荧光技术开发了新的应用。“我们已经将其推进到了下一个合理的阶段，那就是将其应用于患者，”同时也是头颈外科医生的罗森塔尔说道。大约20年前，罗森塔尔和他的团队开始测试注射荧光抗体是否可以通过标记肿瘤边缘来帮助外科医生，因为肿瘤边缘往往难以与健康组织区分开来。这些研究以及其他科学家的研究表明，这项技术可能有益。罗森塔尔表示，使用免疫荧光技术，“你可以在手术室实时识别癌症”，一些外科医生也使用这项技术来指导手术刀的操作。

罗森塔尔和他的同事们目前正在努力确定免疫荧光技术是否可以帮助医生选择接受免疫检查点抑制剂治疗的患者，并微调这些基于抗体的癌症治疗的剂量。检查点抑制剂在十多年前首次获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，得克萨斯大学MD安德森癌症中心的詹姆斯·艾利森（James Allison）因此获得了2015年拉斯克-德贝基临床医学研究奖，并分享了2018年诺贝尔生理学或医学奖。罗森塔尔表示，研究人员仍未确定这些治疗的最佳剂量。“令人惊讶的是，我们认为这是精准医疗，但我们给每个人都使用相同剂量的抗体。”他表示，确定最有效的剂量尤为重要，因为这些药物每剂的成本约为1万美元。

尽管检查点抑制剂对20多种癌症有效，并能治愈一些患者，但只有约20%的接受者能从中受益。罗森塔尔和他的同事们希望提高这一比例。他们之前使用荧光标记抗体的研究表明，这些药物往往无法在肿瘤中均匀分布。“有些区域药物无法到达，”他说道。今年，研究人员启动了一项临床试验，以确定修改药物剂量是否能使药物分布更加均匀。参与者均为头颈部癌症患者，他们将接受不同剂量的检查点抑制剂帕尼单抗以及一种改良版的荧光标记抗体。在手术切除肿瘤后，罗森塔尔和他的同事们将测量样本中的荧光强度，以确定帕尼单抗在癌组织中的渗透程度，从而推断出最有效的剂量。罗森塔尔表示，如今患者接受的是他们所能承受的最高剂量，但这种药物“可能在最大耐受剂量的二分之一或三分之一时就能发挥作用”，这可能会减少副作用并提高治疗效果。

麦克德维特指出，库恩斯性格腼腆，“对于自己的方法取得了如此广泛的成功，他仍感到有些惊讶，甚至有些尴尬。”库恩斯写道，他之所以能提出自己的标志性想法，是因为他做了大量的知识储备，并且有时间让“潜意识发挥作用”。他写道，通往创造性突破的道路是“首先，用事实充实头脑，并为之奋斗；然后是潜伏期；最后，突然领悟到解决方案。”

来源：科学小Z