摘要：大豆作为关键食用蛋白与油脂作物，常受病原体侵袭而减产。为应对此问题，大豆凭借自然抗性机制生成异黄酮类植物抗毒素，如大豆抗毒素，兼具抗菌、抗真菌、抗癌、抗炎及抗氧化等多重功效。大豆主要产生三种大豆抗毒素（I、II、III）。尽管可从大豆中分离，但现有方法耗时且不

西湖大学洪本科团队，浙江大学连佳长团队合作在Molecular Plant上联合发表了题为“

Elucidation and de novo Reconstitution of Glyceollin Biosynthesis

”的研究成果，完整解析了大豆抗毒素（glyceollins）的生物合成途径，并通过合成生物学与代谢工程成功在酿酒酵母中实现大豆抗毒素的异源从头合成。

1 研究背景

大豆作为关键食用蛋白与油脂作物，常受病原体侵袭而减产。为应对此问题，大豆凭借自然抗性机制生成异黄酮类植物抗毒素，如大豆抗毒素，兼具抗菌、抗真菌、抗癌、抗炎及抗氧化等多重功效。大豆主要产生三种大豆抗毒素（I、II、III）。尽管可从大豆中分离，但现有方法耗时且不适于大规模生产，促使人们探索替代方案。尽管大豆抗毒素I和II的化学合成已有报道，但步骤复杂、成本高昂，限制了其生物应用。此外，对大豆抗毒素生物合成的了解尚不完整，尤其是最后环化步骤的认识不足，仍是实现通过合成生物学进行可持续生产的主要障碍。

2 研究内容

该研究成功鉴定了参与大豆抗毒素I、II和III生物合成的核心酶—负责最后一步环化反应的P450酶。通过分析病原菌侵染后的大豆转录组数据，筛选出28个上调的P450基因。其中，GmGIS1与GmGIS2在烟草叶片中展现出将4-glyceollidin转化为大豆抗毒素I的催化能力，且这一转化过程在酿酒酵母中通过feeding实验得到了验证。同时，研究还发现活性相对较低的同源基因GmGIS3在经历活性位点突变后，其活性得到部分恢复。此外，研究进一步明确了催化大豆抗毒素II和III合成的酶类—GmGIIS与GmGIIIS。GmGIIS负责将glyceocarpin转化为大豆抗毒素II，而GmGIIIS则催化大豆抗毒素III的形成，两者均通过酵母饲喂实验确认。其同源基因GmGIIISp因关键位点突变而丧失活性，但通过突变实验，其活性得到部分恢复。这些发现不仅揭示了相关P450酶在大豆抗毒素生物合成过程中的作用机制及其活性结构基础，还为通过酶工程手段改良大豆抗毒素的生产提供了潜在策略。

研究团队鉴定了负责将2'-OH dihydrodaidzein（4）转化为THI（5）的还原酶GmTHIS（图1）。团队先通过苜蓿VR蛋白序列在大豆基因组BLAST筛选出7个候选基因，再经烟草叶片瞬时表达及QTOF-HRMS分析，确认其中六个基因具有催化活性（GmTHIS1、GmTHIS2活性最佳），并最终通过体外酶活测试验证其催化功能。

图1. 三种大豆抗毒素的生物合成通路（a）以及大豆抗毒素合成酶在烟草（蓝色）中瞬时表达实验以及在酿酒酵母（黑色）中饲喂实验的LCMS图（b）

在全面解析大豆抗毒素生物合成途径后，为实现其从头合成，研究团队采用模块化设计策略，将16步异源反应划分为三大模块（大豆苷元→Glycinol→Glyceollins），并逐步在酵母中进行重构（图2）。首先，构建大豆苷元从头合成模块，通过优化L-酪氨酸代谢流、异源酶融合表达等手段，能够合成~24 mg/L的大豆苷元。随后，构建glycinol模块，整合关键酶基因，实现大豆苷元向Glycinol的高效转化。最后，针对Glyceollins模块中异戊烯基化和环化两大限速步骤，通过切除信号肽、ERG20动态调控及关键酶融合表达等策略提高异戊烯基化效率，成功实现4-Glyceollidin和Glyceocarpin生物合成；通过N端信号肽替换和基因拷贝数优化提高环化效率，最终将Glyceollin I、II和III的产量分别提升至0.51 mg/L、0.0090 mg/L和0.31 mg/L（图2）。

图2. 在酿酒酵母中从头合成大豆抗毒素I, II和III

作者简介与致谢

西湖大学博士后孙云龙和浙江大学博士生陈聪为共同第一作者，西湖大学洪本科研究员和浙江大学连佳长研究员为共同通讯作者。西湖大学科研助理林超和张浩也参与了本研究。本研究获浙江省自然科学基金（资助对象：B.H.）以及国家自然科学基金（资助对象：J.Z.）资助。我们衷心感谢西湖大学启动资金、西湖大学未来产业研究中心以及浙江省重点实验室建设项目（资助对象：B.H.）提供的资金支持。

责编：Wang

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来源：小方的科学世界