摘要：乙酰辅酶A是细胞代谢和能量产生中的关键分子。作为细胞内不同代谢途径的中心枢纽，乙酰辅酶A在三羧酸循环中发挥核心作用，产生富含能量的分子（如ATP），并且是脂肪酸、胆固醇及其他重要细胞组分合成的前体。其多功能性和重要性使乙酰辅酶A成为维持细胞过程和整体代谢稳态的

乙酰辅酶A是细胞代谢和能量产生中的关键分子。作为细胞内不同代谢途径的中心枢纽，乙酰辅酶A在三羧酸循环中发挥核心作用，产生富含能量的分子（如ATP），并且是脂肪酸、胆固醇及其他重要细胞组分合成的前体。其多功能性和重要性使乙酰辅酶A成为维持细胞过程和整体代谢稳态的基本分子。多种酶缺陷对乙酰辅酶A代谢有不利影响，其中包括丙酮酸脱氢酶缺乏症、枫糖尿症、酮硫解酶缺乏症、HMG-CoA裂解酶缺乏症和多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症。AkrivisBio的乙酰辅酶A检测试剂盒是一种简单、灵敏的检测方法，可用于测量多种样本中的乙酰辅酶A含量，检测范围为0-400皮摩尔。

艾美捷乙酰辅酶A测定试剂盒：

货号：MA-0127

样本类型：细胞裂解液、组织提取液

适用物种：通用（适用于所有物种）

检测方法：荧光法，激发/发射波长=535/587纳米

检测类型：定量

应用：基于微孔板的荧光法检测，用于定量生物样本中的乙酰辅酶A水平。

灵敏度：0-400皮摩尔

储存条件：-20°C

运输条件：凝胶冷藏包

乙酰辅酶A测定试剂盒检测组分：

-检测缓冲液：25毫升，货号WMMA-0127-A

-二氢荧光素二钠：0.2毫升，蓝色，货号MA-0127-B

-磷酸转乙酰酶：0.1毫升，绿色，货号MA-0127-C

-α-酮戊二酸脱氢酶/二氢荧光素二钠：0.5毫升，紫色，货号MA-0127-D

-α-酮戊二酸：冻干粉，红色，货号MA-0127-E

-灭活剂：1.0毫升，橙色，货号MA-0127-F

-灭活中和剂：冻干粉，透明，货号MA-0127-G

-乙酰辅酶A标准品：冻干粉，黄色，货号MA-0127-H

乙酰辅酶A测定试剂盒检测原理：

1.样本中的乙酰辅酶A被水解为辅酶A和乙酸。

2.在NAD和α-酮戊二酸存在的情况下，α-酮戊二酸脱氢酶将辅酶A转化为琥珀酰辅酶A，过程中生成NADH。

3.NADH被二氢荧光素二钠还原为具有强烈荧光的荧光素。

储存和处理：

将试剂盒储存于-20°C。打开试剂瓶前请短暂离心。

-检测缓冲液：使用前将检测缓冲液恢复至室温。储存于4°C。

-二氢荧光素二钠；灭活剂：直接使用，室温下解冻。储存于4°C。

-α-酮戊二酸：用220微升检测缓冲液溶解。储存于-20°C。

-灭活中和剂：用220微升去离子水溶解。使用时保持在冰上。储存于-20°C。

-乙酰辅酶A标准品：用100微升去离子水溶解，配制成10mM的溶液。使用时保持在冰上。储存于-20°C。

检测步骤：

1.标准曲线：

-0-500皮摩尔范围：将乙酰辅酶A标准品稀释100倍，将10微升转移至990微升去离子水中。进一步稀释，将20微升转移至180微升水中。最终工作溶液浓度为10微摩尔。将0、10、20、30、40、50微升分别转移至96孔板的多个孔中，用去离子水将所有孔的体积调整至50微升，得到每孔0、100、200、300、400、500皮摩尔的乙酰辅酶A标准系列。

-0-100皮摩尔范围：将乙酰辅酶A标准品稀释100倍，将10微升转移至990微升去离子水中。进一步稀释，将10微升转移至490微升去离子水中。混合均匀。将0、10、20、30、40、50微升分别转移至96孔板的多个孔中，用去离子水将所有孔的体积调整至50微升，得到每孔0、20、40、60、80、100皮摩尔的乙酰辅酶A标准系列。

2.样本准备：

-样本中的酶会迅速降解乙酰辅酶A，干扰检测。使用PI-0102、PI-0103或等效方法对样本进行去蛋白处理。组织样本（20-1000毫克）应迅速冷冻（液氮或甲醇/干冰），称重并研磨。加入2微升1N高氯酸/毫克样本。保持低温，通过匀浆或超声处理破坏样本。以16,000×g离心。用3M碳酸氢钾中和上清液，加入1微升/10微升上清液的1微升等分量，同时涡旋，直到气泡生成停止（2-5个等分量）。置于冰上5分钟。检查pH（使用1微升）应约为pH6-8。以16,000×g离心2分钟沉淀高氯酸钾。将10微升样本转移至96孔板的成对孔中；用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

-样本中的游离辅酶A、丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A会产生背景信号。为了校正背景信号，向所有标准品、样本和背景对照中加入10微升灭活剂以猝灭游离辅酶A。室温下孵育5分钟，然后加入2微升灭活中和剂，混合并孵育5分钟。此外，为每个样本运行一个背景对照，通过省略转化酶来校正琥珀酰辅酶A或其他辅酶A酯。

3.启动反应：每个反应需要50微升反应混合液。

4.测量：使用激发波长535纳米、发射波长587纳米的荧光读取器监测荧光。存在一种非常缓慢的线性自催化反应，其发生与乙酰辅酶A的量成正比。为了校正这一点，确定反应开始后10-15分钟的漂移率，并将该速率外推回0时间（反应混合液加入时间）。

5.典型结果：

6.计算：

-从所有读数中减去0标准品的读数。背景信号可能较大，必须从样本读数中减去。确定每个样本的背景值，并从原始乙酰辅酶A读数中减去，以获得校正后的乙酰辅酶A荧光。绘制标准曲线并确定标准曲线的斜率。将标准曲线的斜率应用于校正后的样本读数，以获得样本孔中的乙酰辅酶A皮摩尔数。确定原始样本中的乙酰辅酶A：

-A.孔中的乙酰辅酶A皮摩尔数/加入孔中的样本微升数=样本中的乙酰辅酶A皮摩尔/微升

-B.样本中的乙酰辅酶A皮摩尔/微升×样本总体积=样本中的总乙酰辅酶A

-C.样本中的总乙酰辅酶A/毫克组织（或细胞数量等）=每毫克组织（或细胞数量等）中的乙酰辅酶A皮摩尔

来源：老田说科学