Nat Commun丨茹衡与吴姗课题组合作报道高致病性马尔堡和埃博拉病毒RNA依赖的RNA聚合酶复合物的冷冻电镜结构

摘要：埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）和马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）同属于丝状病毒科（Filoviridae），是一类在电镜下呈现出长而细的病毒,它们是非分段负链RNA病毒（nsNSVs）。根据世界卫生组织报道，埃博拉病毒和马尔堡

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）和马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）同属于丝状病毒科（Filoviridae），是一类在电镜下呈现出长而细的病毒,它们是非分段负链RNA病毒（nsNSVs）。根据世界卫生组织报道，埃博拉病毒和马尔堡病毒感染引起的出血热在过去几十年里造成了多次严重的疫情。患者通常在接触病毒2-21天后，出现发热、出血、器官衰竭、休克等症状，具有极高的死亡率。在侵染宿主细胞后，病毒基因组复制和转录的过程由聚合酶复合物介导，该复合物由L蛋白及其辅助因子VP35组成，对病毒的增殖至关重要。此外，与病毒的包膜蛋白相比，聚合酶蛋白在进化上相对保守，所以具有作为广谱抗病毒药物靶点的潜力。因此，获得高分辨率的聚合酶复合物的结构对于研究丝状病毒RNA合成的分子机制及开发抗病毒药物都具有非常重要的意义。

2025年3月31日，浙江大学生命科学研究院茹衡团队和湖北大学生命科学学院吴姗团队合作在Nature Communications杂志上发表了题为

Structural insights into the RNA-dependent RNA polymerase complexes from highly pathogenic Marburg and Ebola viruses的研究论文，首次报道了马尔堡病毒以及处于收缩构象的埃博拉病毒RNA聚合酶复合物的高分辨率冷冻电镜结构。

利用冷冻电镜技术，研究人员对MARV和EBOV RNA聚合酶复合物的结构解析至分辨率分别为2.7 Å和3.1 Å，结果显示两种病毒的聚合酶复合体在组装方式和整体结构上高度相似。其中L蛋白解析出核心区域，包括催化RNA合成的RdRp 结构域和负责催化新生mRNA加帽的PRNTase结构域，4个VP35分子分别处于不同的长度及构象，通过寡聚化结构域OD形成四聚体并结合在L蛋白的RdRp结构域上。在MARV聚合酶中，因priming loop的部分缺失及intrusion loop退回至PRNTase结构域，表明所解析的MARV聚合酶的结构处于延伸或非起始状态。

基于这两种病毒聚合酶结构的相似性，研究人员将MARV聚合酶的RdRp结构域与EBOV聚合酶结合抑制剂suramin的结构进行比较【1】，发现在MARV的RdRp结构域上能够找到对应的保守结合口袋，但是通过MST方法测量发现suramin与MARV聚合酶的亲和力远低于其与EBOV聚合酶的亲和力。由于EBOV聚合酶中suramin的结合口袋中只能看到一半suramin分子的密度，推测另一半分子可能阻碍了其与MARV聚合酶的结合，这意味着丝状病毒的RNA聚合酶之间可能存在一定的结构差异。因此，在开发MARV聚合酶抑制剂时，可能无法直接沿用EBOV聚合酶的抑制剂。

除此之外，研究人员通过对比已发表的EBOV聚合酶的结构【1, 2】，发现本研究获得的EBOV聚合酶RdRp结构域中的NTD、fingers、thumb亚结构域和PRNTase结构域均发生了向内移动（基于palm亚结构域叠加结构进行比较），位移幅度约为2.0–4.8 Å，这导致中心腔室及RNA模板进入通道的收缩，因此本研究获得的EBOV聚合酶处于一个之前尚未报道过的收缩构象。通过与结合RNA启动子的EBOV聚合酶的结构进行比较【2】，发现该结构中的RNA启动子与处于收缩构象的EBOV聚合酶在RNA模板进入通道处产生明显的空间位阻，这揭示了聚合酶在RNA合成过程中可能通过有节律的松弛和收缩产生构象变化，促进模板RNA不断被挤压到催化口袋中，在RNA合成过程中有助于模板的易位。

丝状病毒的复制启动子在序列上高度相似，其中EBOV仅比MARV在基因组3’端多一个碱基。通过与结合RNA启动子的EBOV聚合酶结构相比【2】，发现该RNA模板可被容纳于MARV聚合酶的模板进入通道中，且RNA结合位点在不同种属间高度保守，表明丝状病毒可能通过相似机制捕获基因组3’端。进一步建模显示，EBOV与MARV聚合酶在从头合成RNA的过程中，最早合成的两个核苷酸分别与EBOV模板的+2/+3位或MARV模板的+1/+2位互补，位于催化磷酸二酯键形成的palm亚结构域的活性中心。该模型揭示了RNA从头合成的分子机制，并解释了EBOV聚合酶从+2位起始、而MARV聚合酶从自身模板+1位或EBOV模板+2位起始的现象。此外也解释了为何MARV聚合酶能在minigenome系统中识别并利用自身及EBOV的leader序列完成复制与转录。

尽管MARV和EBOV聚合酶在整体结构和功能性基序上具有较高的保守性，研究者发现L与VP35的相互作用具有一定的种属特异性。将EBOV的VP35通过OD和CR结构域叠加至MARV的VP35上时，发现EBOV VP35的IID会发生明显的向外移动，削弱了其与L的亲和力。反之，若将EBOV的VP35通过IID叠加至MARV的VP35上时，其OD和CR区域与MARV的RdRp结构域发生明显的空间位阻。此外，在VP35与L的结合表面，参与互作的氨基酸残基及部分二级结构存在显著差异，这些特征推测会阻碍L蛋白与异源VP35形成功能完备的聚合酶嵌合体，这揭示了丝状病毒在进化过程中由于选择压力使L及VP35以相似的序列和保守的结构同时进化，这可能暗示了RNA合成过程和致病性机制的潜在差异。

综上，这项工作解析了MARV和EBOV这两种高致死性丝状病毒的RNA聚合酶复合物近原子分辨率的冷冻电镜结构。MARV和EBOV之间L–VP35相互作用的差异，以及EBOV聚合酶结构的动态变化，拓宽了我们对丝状病毒聚合酶复合物在复制过程中如何组装和功能的理解。此外该研究结果还为RNA合成过程中的起始和延伸过程的机制提供了见解，这对于开发针对这些高致命性EBOV和MARV以及其他非分段负链RNA病毒的抑制剂的研发具有十分重要的意义。

浙江大学生命科学研究院、浙江大学医学院附属第二医院和浙江省癌症分子生物学重点实验室的博士后李国保、博士生杜天娇和湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程国家重点实验室的博士生王洁宁为论文共同第一作者，博士生揭凯悦和硕士生任卓露也参与了实验工作。浙江大学生命科学研究院茹衡研究员和湖北大学生命科学学院吴珊教授为共同通讯作者。该研究得到了中国科学院深圳先进技术研究院张小康研究员和浙江大学生命科学研究院张龙教授的大力支持。

制版人：十一

参考文献

1. Yuan, B., et al., Structure of the Ebola virus polymerase complex.Nature, 2022.610(7931): p. 394-401.

2. Peng, Q., et al., Molecular mechanism of de novo replication by the Ebola virus polymerase.Nature, 2023.622(7983): p. 603-610.

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