摘要：以环保的方式推进农业生产将是满足未来食品安全需求的关键部分。目标信使RNA（mRNA）的下调，依赖于在植物体内或通过喷洒特制的RNA分子，这代表了农业害虫/病原体核苷酸序列特异性管理的扩大领域。在这里，讨论了几种当前商业RNA干扰（RNAi）应用于提高食品安全

以环保的方式推进农业生产将是满足未来食品安全需求的关键部分。目标信使RNA（mRNA）的下调，依赖于在植物体内或通过喷洒特制的RNA分子，这代表了农业害虫/病原体核苷酸序列特异性管理的扩大领域。在这里，讨论了几种当前商业RNA干扰（RNAi）应用于提高食品安全。也讨论并强调了更多新兴的RNAi基础管理影响食品安全的害虫/病原体的方法，重点关注代表各种潜在应用、概念难题、关注环境以及分类群（包括食物资源和害虫/病原体）的研究。这次讨论旨在展示支持食品安全的已知和较少知名的RNAi应用，并促进对一些有趣的最近探索领域的进一步研究和开发，特别是那些涉及研究不足的领域和那些有最近且高度有希望的研究发现支持的领域。

引言

RNAi，一种可能的持久解决食品安全问题的方法，在平衡地球环境健康与需要养活指数增长的人口之间，食品安全问题引起了极大的关注。为食品安全提供保障的最关键难题之一是管理那些有能力破坏食品生产超过经济阈值的害虫。害虫管理常常依赖于使用各种化合物/化学物在配方中，这些被特别分配用以对抗有问题的害虫种群。然而，大量使用害虫控制化合物在很多情况下导致了对用于害虫管理的化合物产生抵抗性。此外，农药的使用，连同其他因素，持续导致全球生物多样性的减少，这是维持生态系统服务（包括与食品安全相关的服务）的关键资源，并在地球的环境中广泛存在。

幸运的是，农药技术中已经有了颠覆性的发展，这些发展可以极大地减轻生物多样性的损失，甚至可能防止在目标害虫种类中产生农药抗药性。其中一种发展就是生产和使用专门为害虫管理定制的RNA分子。这些分子可以用来针对维持目标生物和/或其种群所必需的内源mRNA区域。简单来说，专门定制的RNA（例如，dsRNA，miRNA）分子被目标生物内的细胞吸收，其中外源RNA分子被视为异质颗粒并通过Dicer酶进行切割，生成约21bp的小干扰RNA（siRNAs）。然后，RNA诱导的沉默复合体（RISC；一个含有Argonaut蛋白作为其活性中心的多蛋白复合体）与互补的内源信使RNA（mRNA）分子结合并将它们降解，使这些mRNA无法翻译成相应蛋白的氨基酸序列。这种核苷酸序列特异性的作用模式使得目标物种能够通过RNA干扰（RNAi）生物农药应用受到影响，同时通常不影响非目标生物（NTOs）。因此，专家们认为RNAi技术是一种与我们实现区域和全球可持续发展目标（SDGs）的害虫管理工具。尽管有关NTOs生物安全性、长期生物多样性影响以及抗药性发展的问题已在其他地方得到了广泛的审视，但在这里，为RNA生物农药技术的发展提供了更广阔的视角，不仅在作物系统中，而且在非作物农业系统中实施（图1）。

RNAi在促进食品安全方面的实施情况

首次商业使用RNAi生物农药是在1998年在夏威夷引入的彩虹木瓜，当时的木瓜环斑病毒（PRSV）正在严重破坏木瓜的生产。这种PRSV抗性品种使木瓜的生产恢复到了PRSV入侵夏威夷之前的水平。彩虹木瓜目前在夏威夷的木瓜市场上仍占主导地位。

市场上也有RNAi苹果品种。奥卡纳根特种水果公司开发了三种使用RNAi技术的苹果品种，这些品种可以实现对多酚氧化酶的有针对性的下调，防止褐变的发生。虽然这并不代表害虫管理实施，但人们可以争论的是，处理这种重要水果中的褐变可能会防止食物浪费（同时也可能导致其他质量控制实施），从而促进食品安全。在美国和加拿大，美国农业部（USDA）内的动物和植物健康检查服务（APHIS）以及加拿大食品检查局和加拿大卫生部在2015年批准了两种Arctic Golden和Arctic Granny品种的销售。另一种Arctic Fuji在2016年在美国获批，2018年在加拿大获批。这些RNAi Arctic Apple品种已被确定为对人类、家畜和环境的安全性与非转基因苹果相同。

在2017年，美国环保署（US-EPA）批准了首次针对昆虫害虫使用RNAi技术，该害虫为西部玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）。这再次通过种植含有RNAi特性的品种来实现，其中设计的RNA分子（在昆虫害虫中触发RNAi反应）在这些玉米植物的组织中不断产生。更近期，在美国环保署批准了首个可喷洒的RNA基因农药Ledprona的商业使用。其活性成分是dsRNA，针对的是科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）中一个关键的内源基因的产生。Ledprona不仅对L. decemlineata种群有急性致命效应，而且对于管理这些种群也有重要的次致死效应。此外，已经制定了积极的抗性策略，以支持可持续使用。

在其他地方，RNAi基因沉默技术作为生物农药的使用仍在继续被考虑。例如，肯尼亚国家生物安全局在2021年批准了4046木薯的上市，这是一种对木薯褐斑病毒和乌干达木薯褐斑病毒都有抗性的RNAi品种，这两种病毒是木薯褐斑病的两个关键原因。这项工作对肯尼亚至关重要，因为在那里，食品安全仍然是一个持续的挑战。周边地区也几乎肯定会从RNAi作物生物技术的引入中受益。因此，应更加关注确保这些处于风险中的国家的农作物保护的未来。

如上所述，RNAi技术在农业中有许多其他可能的应用。这些潜在应用许多仍在实验阶段被研究，而这些研究正在全球范围内进行，因为人们正转向RNAi技术以解决食品安全的可持续性危机。关于全球南方小农户的社会经济和伦理影响，特别是17个可持续发展目标（SDGs）中所整合的考虑，已经在前面的讨论中提到过，并且由于RNAi生物农药研究和开发的重生物地理倾向，这依然是一个重要领域。

RNA生物农药保证可持续食品安全

定制RNA为基础的生物农药的能力允许我们开发利用目标害虫生物学和生命周期的特定方面的方法/产品。尽管针对维持个体基本细胞功能所必需的基因的目标旨在导致目标害虫的死亡，但其他基因目标适合进行下调，其中一些可能代表同样有效的目标，并对非目标生物（NTOs）施加的风险很小。确实，有许多基因目标具有极大的潜力，可被用于对抗产量损失，同时减少总体农药使用量（或以环保安全的方式引入生物农药），在食品生产系统中。Willow等人之前回顾了少量几项研究，这些研究展示了针对广泛谱杀虫剂或植物化感物质抗性分子的靶向下调。从那时起，Chen和Palli 已经额外证明了一个P450基因，CYP321A8，在棉铃虫（Spodoptera frugiperda）中对拟除虫菊酯杀虫剂deltamethrin的解毒作用。此外，作者在口服杀虫dsRNA后观察到，在昆虫开始RNAi的主要部位—中肠中，CYP321A8的表达明显上升。这些研究的结果引发了一个重要的问题：是否有可能实施双重方法，即定制的RNAi生物农药针对目标害虫中的特定抗性分子，同时也使用传统农药，但其浓度要低得多，因而对环境的风险更小，以有效管理目标害虫（图1a）。

图 1. 开发或研究RNAi介导控制的农业害虫/病原体情景

针对植物病毒的RNAi生物农药技术可能成为减少某些作物系统中杀虫剂使用的一种方法。例如，许多情况下，由于其病毒媒介行为而成为问题的刺吸式昆虫可能不需要杀虫剂管理，如果它们作为害虫群体的地位依赖于通过RNAi技术有效控制的植物病毒的存在。Worrall等人已经证明了在消除这种病毒之后，通过喷洒dsRNA可以破坏蚜虫介导的豆科普通花叶病毒的传播。应进一步对其他刺吸式害虫分类群（如蓟马）进行研究，以巩固这种方法作为减少常规杀虫剂投入的有效措施，在这些化学投入可能不必要的地方。

与低剂量RNA生物农药的摄取相关联的亚致死效应，或与利用特定遗传目标的替代效应相关联的亚致死效应，可为基于RNAi的害虫管理提供有利途径。Pallis等人证明，暴露在低剂量的Ledprona下会干扰马铃薯甲虫（L. decemlineata）的蛹化，并显著降低其活动能力和繁殖能力。最近的另一项研究表明，针对豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）中两种类似几丁质酶的蛋白质的靶向下调不仅导致处理过的若虫出现异常蜕皮和外壳缺陷（导致早期死亡），而且还导致其后代的繁殖能力下降和几丁质酶mRNAs的表达下调。这表明，一些用于对抗目标害虫的RNAi效应可能是遗传性的，并可能被传递下来，这为对繁殖周期快速的害虫种群的管理提供了潜在的有效策略。

自引入综合病虫害管理（IPM）制度以来，依赖农药投入和生物控制剂种群同时管理害虫种类的能力一直被视为一种平衡技巧。RNAi基因沉默技术为基础的生物农药在实现可持续的IPM以及使用生物控制剂方面的潜力已在文献中进行了详细讨论。表1展示了一些研究的例子，这些研究检验了RNAi生物农药与各种重要生物控制昆虫之间的兼容性。总的来说，这些研究提供了宝贵的证据，支持将RNAi生物农药引入到部分依赖生物控制剂种群进行有效害虫管理的种植系统中。

RNA生物农药技术的兴趣领域新兴趋势也包括农场相邻系统，如养蜂和畜牧系统（图1c，d）。dsRNA的使用已经作为控制瓦螨（Varroa destructor）的方法在开发中，这是全球蜜蜂养殖的最大威胁。McGruddy等人最近通过使用针对V. destructor中的钙调蛋白的dsRNA产品，显著降低了V. destructor的繁殖力，且对蜜蜂没有负面影响。此外，2023年，新西兰的养蜂人表示愿意在蜜蜂巢箱中使用RNA生物农药来控制瓦螨，尽管仍存在进行更多风险评估研究的一些担忧。与养蜂应用不同，对RNAi介导的害虫控制的研究仍处于起步阶段。然而，鉴于畜牧业中害虫问题的恶化、低风险农药可用性的降低、农药抗药性的案例增加、害虫种群的普遍增加，以及dsRNA分子对家畜等哺乳动物的威胁可以忽略不计，该领域的开发有一定的推动力。

水生和半水生生态系统是可持续和生物安全农药技术开发的关键焦点，RNAi生物农药正在被审查，用于管理这些环境中对食品生产构成各种威胁的物种。为此，许多病毒，甚至是软体动物和刺胞动物门的成员，都已被研究。病毒疾病在虾业中构成重大且持续的挑战，而RNAi基础治疗在虾孵化场的潜力尤其有价值。为了管理影响虾业的几种病毒，科学家已经通过预防性和治疗性应用dsRNA有效地抑制了病毒复制。Øvergård等人的一项研究证明了通过dsRNA处理可以消除Lipeophtheirus salmonis中的两种垂直传播的病毒。

近期，Kyslík等人进行了一项概念验证研究，展示了RNAi介导的肌动蛋白基因的下调在寄生虫Sphaerospora molnari中，该寄生虫感染常见的鲤鱼（Cyprinus carpio），在野生和养殖鱼类群体中引起急性疾病。通过消除上述病毒和寄生虫以保护鱼类养殖操作仍然是一个关键的R&D途径，考虑到对养殖鱼类资源的广泛依赖以及这些病毒和寄生虫在大规模养殖地点的潜在无所不在（图1e）。斑马贻贝（Dreissena polymorpha），起源于乌克兰和南俄罗斯，已被引入许多国家，并被列为地球上最具侵袭性的水生物种之一。此外，它可以大幅度改变水生食物网，影响人类群体的食物资源。目前正在探索使用RNAi生物农药技术和其他基因生物控制技术进行这种D. polymorpha的管理。

虽然半水生食品系统（如水稻生产）相比于上述全水生系统更具有常规的研究焦点，但半水生系统仍然代表了一个复杂的RNA生物农药研发的途径。如果应用技术是喷洒式的，那么全面被水淹没的种植系统必然会改变应用杀虫RNA的方法，因为应用的RNA分子在淹没的底物和裸露的土壤之间可能会有非常不同的环境命运。事实上，最近已经针对白背飞虱（Sogatella furcifera）进行了基于RNAi的管理研究，以实现在水稻种植系统中的可持续的集成害虫管理（IPM）。由于水稻可以说是最重要的粮食作物，是全球一半以上人口的主要热量来源，因此需要更多的关注，将水稻作为下一个受RNAi生物农药保护的作物。在完全被水淹没的种植系统中应用RNAi技术，也需要大量的关注和创新才能实现这一目标。

在农业系统中，害虫种类造成了极大的困扰，这是RNA生物农药研发的关键探究途径（图1b）。尽管科学家们已开始研究像红火蚁（Solenopsis Invicta）这样的物种作为潜在的RNAi饮食管理候选对象，但对此进行初步研究的基本方法仍需要进行修改（例如，由于对照组死亡率非常高）。此外，向田间输送RNAi饮食的潜在方法尚未被探索，这可能会成为实施这项生物技术的巨大障碍。

RNA生物农药研发方法的主要更新正在为两个领域带来巨大的成功。例如，使用含有粘土纳米粒子的层状双氢氧化物对抗病毒、昆虫和真菌时观察到的显著增强的农作物保护效果，标志着可喷洒RNAi生物农药开发的重大进步。这些产品正通过昆士兰大学与澳大利亚农用化学品公司Nufarm的合作伙伴关系进入RNAi生物农药市场。其他针对目标害虫/病原体的有效RNAi的纳米粒子/载体介导传递技术，也是当前研究环境中强化RNAi为基础的管理效能的强大焦点。农作物遗传工程的新方法可能证明对某些类型的有害昆虫害虫的RNAi为基础的管理有极大的益处。为此，Wu等人表明，通过产生转质体植物（在叶绿体基因组中表达目标特异性dsRNA，而不是在核基因组中）的质体介导RNAi，可以对某些刺吸植物细胞内叶绿体的害虫产生显著更大的害虫管理效果。这个关键发现可能在开发对蓟马种类和显示类似植物取食策略的节肢动物有效的RNAi实施中起到关键作用。最后，早期RNAi研究中的新方法可能对数据生成的可行性产生极大的积极影响。例如，Alegria等人开发并演示了果蝇（Drosophila melanogaster）和斑马鱼（Danio rerio）胚胎的微注射系统。这种新方法可以用于高通量筛选RNAi目标分子，包括目标害虫的其他生命阶段（如幼虫，若虫）以及非目标生物。

讨论RNA生物农药在半田间设置中的适当效能水平是非常关键的，即使实验室阶段取得了成功，也不能预期在所有系统中都达到这种效能。例如，Willow等人进行了一项受控的半田间实验，以更接近实际田间环境的方式检查了基于RNAi的Brassicogethes aeneus的控制情况，这与他们之前在实验室环境中的实验相比。作者证明了喷洒的dsRNA在植物体内的转移，不仅转移到喷洒芽的花中不同的解剖结构，还转移到新出现的（未喷洒新生长的）花芽的所有结构，这是在喷洒后的九天内发生的。虽然B. aeneus成虫继续在这些处理过的植物上进行慢性取食（用低和高浓度的dsRNA制剂进行处理），并显示出对目标mRNA下调的浓度依赖性趋势，但在对喷洒的油菜籽植物上的dsRNA进行11天的慢性饮食暴露后，并未观察到对花粉甲壳虫生存的影响。仅在鞘翅目这一纲中，这些低至中等RNAi敏感性的情况是预期的，并且这种模式可能适用于许多其他昆虫和非类群。

确定生物学上（如对RNAi敏感度适中的物种，例如上述的B. aeneus，这是该领域内的一个主要关注害虫）、社会上（例如，增加消费者对RNAi食品技术的理解）以及经济上（即，对研发和产品应用的有效经济模型）最迫切的障碍对于继续这个领域近几十年来所取得的显著进步至关重要。正如前文所述，McGruddy等人研究了新西兰养蜂人对RNAi生物农药处理瓦螨在蜂箱中管理的方法的看法。在所有食品生产部门进行更多这种类型的研究，可以显著提高全球对可以实现的目标以及其对环境和消费者的相关安全性的理解。这可能说服消费者、农业从业者和资金提供者将更多的资源投入到RNA生物农药研发以及现有和未来市场产品中。

来源：中国农药工业协会