Nat Neurosci | 郭俊杰团队揭示C9orf72基因重复扩张通过异常剪接实现外显子化的分子机制

摘要：C9orf72 基因的 (GGGGCC) n 核苷酸重复扩增（Nucleotide repeat expansion/NRE）是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传病因，约占西方人群家族性病例的40%。该重复序列位于基因的第一个内

C9orf72 基因的 (GGGGCC) n 核苷酸重复扩增（Nucleotide repeat expansion/NRE）是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传病因，约占西方人群家族性病例的40%。该重复序列位于基因的第一个内含子区域，正常情况下应在转录后通过剪接被移除。然而，此前研究发现扩增后的内含子重复序列能够通过重复关联的非AUG翻译（Repeat-Associated Non-AUG translation）产生五种毒性双肽重复蛋白（ Dipeptide repeat proteins/DPRs ），包括聚甘氨酸-丙氨酸（ PolyGA ）、聚甘氨酸-脯氨酸（ polyGP ）、聚甘氨酸-精氨酸（ polyGR ）、聚脯氨酸-精氨酸（ polyPR ）和聚脯氨酸-丙氨酸（ polyPA ）。这些毒性蛋白在患者神经系统中聚集，引起蛋白质稳态失衡、核质运输障碍等多重细胞功能异常，最终导致神经元死亡。

长期以来，领域内存在一个关键科学问题：扩增后的内含子重复序列是如何逃避剪接切除，进而进入细胞质参与翻译的？先前主要存在两种假设模型：一是扩增后的重复序列导致整个内含子1滞留于mRNA上；二是剪接切除的内含子 1 套索结构被稳定化并输出到细胞质。然而，由于这些含有重复序列的异常转录本在细胞中丰度极低，传统转录组测序技术难以对其进行精确解析。

近日，耶鲁大学医学院郭俊杰教授团队（第一作者为杨溯周）在Nature Neuroscience发表题为Aberrant splicing exonizes C9orf72 repeat expansion in ALS/FTD的重要研究。该研究通过创新性地开发NRE-capture-seq技术，首次系统阐明了C9orf72基因中GGGGCC六核苷酸重复扩张通过异常剪接机制被保留为延伸外显子1组成部分的分子通路，为ALS/FTD的治疗提供了新的靶点和方向。

为解决上述技术瓶颈，研究团队开发了NRE-capture-seq技术。该方法使用5'-生物素标记的(CCCCGG) 3 反义寡核苷酸（ 5'-biotinylated antisense oligonucleotides ），通过液相杂交特异性捕获含有(GGGGCC) n 重复序列的RNA分子，随后进行低起始量RNA测序。通过对捕获序列的深入分析，研究团队获得了突破性发现：C9orf72重复扩张阳性（C9 NRE+）患者的成纤维细胞质中含(GGGGCC)n重复序列的转录本并非此前认为的完整内含子或套索结构，而是通过使用位于重复序列下游的多个隐蔽5'剪接位点，将内含子1部分序列异常剪接为外显子1的延长部分。

研究鉴定出三种主要的异常剪接异构体：使用经典Ex1b位点的异构体、使用内含子内隐蔽位点Ex1c和Ex1d的异构体。值得注意的是，所有这些异构体都使用相同的3'剪接位点 Ex2 ，这解释了为什么测序读段主要分布在内含子1的5'半部分，而3'半部分几乎无读段覆盖。

研究进一步在疾病相关细胞类型——运动神经元中验证了这一现象。通过将C9 NRE + 患者来源的iPSCs分化为运动神经元，发现其中Ex1c-Ex2剪接的表达量比对照组高出近30倍。特别值得注意的是，不同细胞类型对剪接位点的选择存在显著差异：在C9 NRE + 成纤维细胞中，主要使用Ex1b剪接位点；而在C9 NRE + 运动神经元中，Ex1c成为主导剪接位点。这一发现表明，细胞类型特异性因子在调控异常剪接中发挥重要作用，也可能部分解释了为什么某些细胞类型对C9orf72突变特别易感。

为阐明重复扩张激活隐蔽剪接位点的分子机制，研究团队构建了一套双荧光素酶报告基因系统。该系统将不同长度的(GGGGCC)n重复序列插入萤火虫荧光素酶基因与海肾荧光素酶基因之间。实验结果表明，仅当重复次数达到病理阈值（≥33次重复）时，才会显著激活隐蔽剪接位点，这一异常剪接事件最终导致海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶的荧光强度比值显著降低。

通过RNAi筛选已知与(GGGGCC) n 重复序列结合的蛋白因子，发现剪接因子SRSF1是调控这一过程的关键因子。在C9 NRE + 成纤维细胞中敲低SRSF1可显著降低Ex1c-Ex2异构体水平，同时不影响C9 orf72 基因的转录。进一步机制研究表明，SRSF1主要通过促进异常剪接而非直接影响核质运输来调控毒性蛋白产生。

基于上述发现，研究团队探索了两种靶向治疗策略：一是使用靶向SRSF1的siRNA，二是使用直接针对异常剪接接头（如Ex1c-Ex2）的反义寡核苷酸（A ntisense oligonucleotides /ASO）。两种方法在患者来源的成纤维细胞细胞模型中均能显著降低异常转录本和毒性DPR蛋白水平。

特别值得注意的是，靶向剪接接头的ASO能够选择性降解异常剪接异构体，而不影响正常C9orf72 mRNA的表达，这为开发高特异性治疗方法提供了可能。

研究还利用纽约基因组中心-Target ALS联盟提供的人脑组织RNA-seq数据，分析了小脑、运动皮层和额叶皮层中的异常剪接事件。发现Ex1c-Ex2、Ex1d-Ex2和Ex1e-Ex2等异常剪接接头在C9 NRE + 样本中显著上调，而在对照组中几乎检测不到。

特别重要的是，虽然TDP-43蛋白异常聚集是ALS/FTD的典型病理特征，但研究发现C9orf72转录本的异常剪接与TDP-43功能缺失无关，表明这是一种原发性致病事件而非继发现象。

这项研究具有多重科学意义：首先，它揭示了一种新的疾病机制——内含子重复序列通过异常剪接实现"外显子化"，从而获得翻译能力；其次，发现了SRSF1在这一过程中的关键调控作用；最后，提出了靶向异常剪接的治疗新策略。

该机制可能也适用于其他由内含子重复扩张引起的疾病，如肌强直性营养不良2型（CNBP基因内含子1中的CCTG重复）、Fuchs角膜内皮营养不良（TCF4基因内含子3中的CTG重复）和脊髓小脑共济失调36型（NOP56基因内含子1中的GGCCTG重复）等。