Cell | RNA修饰核苷（m6A、m6，6A、i6A）固有的细胞毒性

摘要：表观转录组（ epitranscriptome ）指的是RNA上的各种化学修饰，这些修饰调控转录后基因表达【1,2】。目前为止，已发现超过170种RNA修饰。这些修饰影响RNA的多种功能，包括：决定RNA在细胞中的分布；影响其结构构象；调节解码和翻译；影响mR

撰文 |Sure

表观转录组（ epitranscriptome ）指的是RNA上的各种化学修饰，这些修饰调控转录后基因表达【1,2】。目前为止，已发现超过170种RNA修饰。这些修饰影响RNA的多种功能，包括：决定RNA在细胞中的分布；影响其结构构象；调节解码和翻译；影响mRNA剪接成熟；影响RNA的稳定性等。RNA在细胞内降解后，未修饰的核苷和碱基被回收利用用于核苷酸再合成，或被引导进入降解通路，它们大多被整合进了嘌呤和嘧啶的代谢途径【3】。例如，腺苷（ Adenosine ）可被腺苷激酶（ADK）磷酸化为AMP，再生成ATP；或被腺苷脱氨酶（ADA）去氨为次黄苷（inosine），再转为IMP进入嘌呤合成通路。这些代谢通路的紊乱可导致神经系统和代谢疾病。RNA降解不仅产生未修饰核苷，还会产生大量修饰核苷。以N6-甲基腺苷（m6A）为例，在RNA被降解后释放到细胞外，m6A可激活腺苷A3受体，在小鼠中引发强烈的炎症反应【4,5】。在遭受细胞毒性压力时，m6A的胞外水平会迅速升高，说明这类修饰核苷不仅是降解产物，还是具有生物活性的信号分子。尽管一些修饰核苷已经显示出生理或病理作用，但大多数修饰核苷的功能尚不清楚，它们的调控机制也未被系统解析。

近日，来自日本东北大学的 Fan-Yan Wei 和Akiko Ogawa团队在 Cell 上发表了论文 Adenosine kinase and ADAL coordinate detoxification of modified adenosines to safeguard metabolism 。在本研究中，作者解析了修饰RNA降解产物的细胞毒性机理和其代谢清除途径，为理解相关代谢酶突变引起的疾病提供了新的机制见解。

首先，为了对修饰核苷的细胞毒性有一个全面的了解，作者对52种RNA修饰核苷进行筛选，在多种人类细胞系中检测其对细胞活性的影响。研究发现， m6A （N6-methyladenosine） , m6,6A （N6,N6-dimethyladenosine）和 i6A （N6-isopentenyladenosin）是少数导致细胞毒性的修饰核苷，其作用表现为剂量依赖性的细胞活力下降， m6,6A 和 i6A 毒性最强， m6A 的毒性依细胞类型而异。对含 m6A 的rRNA寡核苷酸细胞毒性分析发现其毒性较弱，表明游离核苷形式的 m6A 类分子才是引起细胞毒性的关键因素。在正常状态下，三种修饰腺苷的胞外浓度极低，但在应激状态下（ H₂O₂、丝裂霉素C、staurosporine处理）会导致胞外水平迅速升高，表明细胞受损时大量RNA被降解，修饰核苷被释放。作者还发现，添加这三类外源修饰核苷，24小时内胞外浓度下降90%。注射入小鼠体内，三种修饰核苷在血浆中的含量始终低于检测阈值，说明其被快速代谢。

随后，作者对三种修饰核苷的代谢酶进行筛选。他们利用抑制代谢酶的小分子筛选库，发现ADK抑制剂（ 5-iodotubercidin,ABT702）几乎完全阻断三种修饰腺苷的清除。ADK将 m6A 转化为 m6A MP， m6,6A 转化为 m6,6A MP，而 i6A 则被转化为 i6A MP。酶动力学分析发现，ADK对三种修饰腺苷的kcat/Km水平与未修饰腺苷相关或更高，且不表现出高浓度底物抑制现象。此外，ADK突变分析发现特定疏水残基（如L16, F170, L40, F201 ）形成N6位取代基结合口袋。ADK敲除细胞中修饰腺苷被积累，再引入ADK表达可恢复清除功能。有趣的是，ADK敲除小鼠表现出新生致死，且修饰核苷在肝脏与羊水中积累。

由于 m6A MP等修饰AMP在细胞中短暂出现后快速消失，作者继续研究ADK下游的代谢酶。他们首先对AMP去氨酶的功能进行研究，发现其抑制剂无法阻止修饰AMP消失，说明另有其它代谢路径。在对ADA进行研究后，作者发现ADAL可以将 m6A MP， m6,6A MP和 i6A MP转化为IMP，但不催化未修饰AMP。在ADAL敲除细胞或小鼠中，修饰AMP显著积累。修饰AMP不会进一步被磷酸化成ADP/ATP，避免其掺入RNA合成或代谢干扰。ADAL缺失小鼠表现出轻度糖耐受异常，其中AMPK通路被修饰AMP抑制。修饰AMP可与ATP竞争结合AMPK，导致葡萄糖代谢基因表达下调。但仅在禁食/低能量状态下表现出异常，说明是应激状态下的代谢失调。除了糖代谢紊乱，作者还发现在ADK缺失小鼠中，脂肪合成和β氧化相关基因下调，脂滴减少、激活自噬通路，表明ADK缺失导致能量代谢紊乱，脂质代谢障碍。重要的是外源添加修饰腺苷也可以再现脂滴减少，脂代谢蛋白下调等表型。

作者继续对修饰腺苷引起细胞毒性的机制进行探究。作者通过使用生物素标记的m6A/m6,6A/i6A进行互作组分析，发现与溶酶体膜蛋白富集互作。电子显微镜显示修饰腺苷导致肝细胞内出现膨胀液泡、消化不完全内容物，提示溶酶体功能受损。 m6A等可导致溶酶体ATP酶亚基（如ATP6V1A）错位、表达下降，溶酶体pH升高，酶活下降。而抑制溶酶体酶或半胱天冬酶可缓解毒性，加上LDH的释放表明修饰腺苷激活的是溶酶体依赖的细胞死亡途径。

最后，作者对疾病相关ADK突变分析发现，多种与肝病和神经系统疾病相关的ADK突变（如G13E、D218A、F302S等）会失去处理m6A, m6,6A, i6A的能力，但不影响对未修饰腺苷的代谢。

总的来说，这项研究揭示了三种RNA修饰核苷（m6A、m6,6A、i6A）具有固有细胞毒性，需通过ADK磷酸化生成修饰AMP，再由ADAL脱氨转化为IMP迅速清除；若该代谢轴受阻，将导致修饰核苷酸积累，进而抑制AMPK活性、破坏脂质代谢与溶酶体功能，诱发细胞死亡和代谢紊乱，解释了部分疾病相关ADK突变的致病机制，强调ADK–ADAL通路在RNA修饰代谢解毒中的关键作用。

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参考文献

1. Roundtree, I.A., Evans, M.E., Pan, T., and He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.Cell169, 1187–1200.

2. Suzuki, T. (2021). The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.22, 375–392.

3. Jurecka, A. (2009). Inborn errors of purine and pyrimidine metabolism.J. Inherit. Metab. Dis.32, 247–263.

4. Ogawa, A., Nagiri, C., Shihoya, W., Inoue, A., Kawakami, K., Hiratsuka, S., Aoki, J., Ito, Y., Suzuki, T., Suzuki, T., et al. (2021).

5. N(6)-methyladenosine (m(6)A) is an endogenous A3 adenosine receptor ligand.Mol. Cell81, 659674.e7.

6. Oshima, H.S., Ogawa, A., Sano, F.K., Akasaka, H., Kawakami, T., Iwama, A., Okamoto, H.H., Nagiri, C., Wei, F.Y., Shihoya, W., et al. (2024). Structural insights into the agonist selectivity of the adenosine A3 receptor.Nat. Commun. 15, 9294.

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