Nat Immunol | CD8⁺ T细胞为何失灵？STUB1按下免疫暂停键

摘要：尽管以免疫检查点阻断（ICB）为代表的免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗的格局，并在多种癌症类型中实现了持久的疗效，但仍有超过50%的患者对ICB无应答或最终出现复发。因此，为了扩大临床受益人群，亟需发现新的肿瘤免疫调控因子，以开发单药或联合ICB的新策略。CD8

撰文 |咸姐

尽管以免疫检查点阻断（ICB）为代表的免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗的格局，并在多种癌症类型中实现了持久的疗效，但仍有超过50%的患者对ICB无应答或最终出现复发。因此，为了扩大临床受益人群，亟需发现新的肿瘤免疫调控因子，以开发单药或联合ICB的新策略。CD8 ⁺ T淋巴细胞是抑制肿瘤生长的关键效应细胞，其功能耗竭与癌症进展密切相关，这使其成为寻找新型免疫治疗靶点的重要研究对象。然而，抗肿瘤CD8 ⁺ T细胞应答受到空间、代谢、细胞及细胞因子等多维度信号的复杂调控，这些过程难以在体外模型中完全模拟。为此，研究人员利用体内CRISPR筛选技术，在小鼠癌症模型中系统探索肿瘤微环境中CD8 ⁺ T细胞应答的潜在调控因子。值得注意的是，既往筛选多采用不同分化状态的T细胞（初始或预激活），且受限于部分基因组覆盖、已知负调节因子干扰或基因组靶向引导RNA（gRNA）回收效率低等问题，大多数基因尚未被系统注释，暗示仍有大量未知的CD8 ⁺ T细胞调控机制等待发掘【1-3】。

因此，近日，来自美国哈佛医学院的Arlene H. Sharpe团队在Nature Immunology上在线发表题为A STUB1–CHIC2 complex inhibits CD8+ T cells to restrain tumor immunity的文章，通过在初始态和活化态的CD8+ T细胞中进行的两项独立的基于CRISPR的899基因功能缺失筛选，发现了肿瘤引流淋巴结（tdLN）和肿瘤微环境中CD8+ T细胞应答的新调控因子。研究证实 E3泛素连接酶STUB1为抗肿瘤免疫的新负向调控因子，阐明STUB1通过与衔接蛋白CHIC2共同作用，降低CD8+ T细胞中细胞因子受体干扰素-γ受体1（IFNγR1）和白介素-27受体α（IL-27Rα）表达，从而限制CD8⁺T细胞功能的分子机制。敲除STUB1或CHIC2可显著增强小鼠多种肿瘤模型的免疫控制，且IL-27Rα为这一过程所必需，由此揭示了靶向STUB1–CHIC2轴以提升肿瘤免疫治疗的新策略。

本文研究人员通过设计包含899个基因的CRISPR文库，分别在初始态和活化态的CD8+ T细胞中进行了体内功能缺失筛选（图1），两种平行筛选方法均回收大量gRNA，生物学重复高度相关，且关键阳性/阴性对照基因表现出一致趋势。对两种筛选结果进行比较后发现，两者腹肌和缺失的基因谱大体一致，但初始T细胞筛选识别出更多与淋巴结中T细胞启动和早期分化相关的基因依赖性，而激活T细胞筛选则鉴定出了更多显著减少的靶点。综合分析两种筛选结果，研究人员发现Stub1 KO CD8 ⁺ T细胞在两组筛选中均显著富集于肿瘤，且效应强度在激活T细胞组更高，说明无论起始状态如何，STUB1均负向调控CD8 ⁺ T细胞在肿瘤内的丰度，因此被选为后续研究的重点。

图1 初始态（上）和活化态（下）的CD8+ T细胞筛选方法示意图

研究人员首先通过体内竞争实验和过继性T细胞转移实验，验证STUB1对CD8 ⁺ T细胞抗肿瘤免疫功能的抑制作用。实验结果显示， Stub1缺失的CD8 ⁺ T细胞在所有检测组织（肿瘤、 tdLN、脾脏）中均显著富集，而且能显著抑制多种肿瘤生长、延长小鼠生存期。为排除STUB1在其他免疫细胞中的潜在影响，研究人员构建了Stub1敲除的骨髓嵌合体模型（BMC），发现其同样能有效控制肿瘤生长，且该效应依赖于CD8 ⁺ T细胞，经CD8抗体耗竭后抗肿瘤作用消失。此外，研究人员还发现， Stub1缺失显著降低SLAMF6 ⁺ TIM3 ⁻ 祖细胞耗竭的CD 8 + T细胞比例、增加TIM3 ⁺ 细胞数量，同时上调对T细胞激活、分化和细胞毒性至关重要的基因的表达，使肿瘤内Granzyme B ⁺ 、PERFORIN ⁺ 、IFN-γ ⁺ CD8 ⁺ T细胞比例显著升高。这些功能增强完全依赖于IFN-γ而不依赖PERFORIN，最终表现为小鼠肿瘤生长受抑、生存期延长。这些研究结果表明，Stub1基因的缺失能够增强CD8+ T细胞中细胞溶解蛋白和细胞因子的表达，并且IFN-γ的产生对于通过过继转移Stub1敲除CD8+ T细胞介导的肿瘤控制效果改善至关重要。

随后，研究人员通过泛素化肽段的质谱分析鉴定了STUB1 在原代 CD8+ T 细胞中的作用底物，结合实验验证，结果证实在T细胞中，STUB1和CHIC2相互作用，且这种相互作用依赖于IFRPD基序的存在。同时， Chic2基因缺失会通过增加CD8+ T细胞数量、增强效应功能及提升肿瘤生长控制能力，呈现出与Stub1缺失相似的表型。研究还发现，Stub1与Chic2双基因敲除相较于单基因敲除并未进一步促进CD8+ T细胞扩增或肿瘤控制，这一发现表明STUB1–CHIC2复合物可能通过协同作用抑制CD8+ T细胞对肿瘤的应答反应。

进一步地，研究人员发现，Stub1或Chic2敲除的CD8 ⁺ T细胞表面细胞因子受体IFNγR1和IL-27Rα表达均显著上调，而其他受体不变，并且这种调节机制在物种中是保守的。同时，实验结果表明STUB1-CHIC2复合物对 IFNγR1和IL-27Rα的调控发生在翻译后，与STUB1的泛素连接酶功能有着直接的联系。研究结果显示，在T细胞中，IFNγR1和IL-27Rα是通过溶酶体降解来调控的，并且STUB1-CHIC2复合物很可能通过泛素介导的溶酶体降解来调控它们的表达。与此同时，研究人员发现， CHIC2的膜定位（而非其自身泛素化）对其调控细胞因子受体功能至关重要，且该复合物并不直接结合IL-27Rα或IFNγR1，而是可能通过空间邻近性促进STUB1对受体的泛素化修饰。深入研究证实，IL-27Rα（而非IFNγR1）是Stub1 KO细胞获得竞争性优势所必需的，Stub1或Chic2敲除细胞上调的Granzyme B、Perforin和IFN-γ表达均依赖IL-27Rα，缺失IL-27Rα则使两种敲除细胞的肿瘤控制能力彻底丧失，小鼠生存期与对照无异。此外，Stub1敲除细胞在tdLN中高表达IL-27Rα和CXCR3，而Stub1/IL-27Rα双敲除细胞则CXCR3表达显著降低，表明IL-27Rα信号通过上调CXCR3表达促进T细胞向肿瘤部位的迁移与积累。这些结果证明，IL-27Rα是STUB1-CHIC2通路下游的关键效应分子，对其信号的增强是Stub1或Chic2敲除CD8 ⁺ T细胞发挥卓越抗肿瘤功能的必要条件。

综上所述，本研究通过分别在初始态与活化态CD8+ T细胞中针对相同基因集进行并行CRISPR功能缺失筛选，实现了双重突破，不仅发现了多个调控CD8+ T细胞抗肿瘤应答的新型因子，还首次实现了对初始态与活化态CD8+ T细胞筛选方法的直接比较。研究结果表明，抑制STUB1可能增强抗肿瘤免疫能力，并揭示了STUB1在调控CD8+ T细胞因子受体表达中前所未有的功能，不仅确立了STUB1与CHIC2作为癌症免疫治疗的潜在靶点，更揭示了细胞因子信号感知在CD8+ T细胞中的新型调控机制。

制版人：十一

参考文献

1. Ribas, A. & Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.Science359, 1350–1355 (2018).

2. McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S. & Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.Annu. Rev. Immunol.37, 1–39 (2015).

3. Dong, M. B. et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.Cell178, 1189–1204 (2019).

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