Science：TRISCO让全脑空间转录组测序与脑成像“完美”结合！

摘要：2024年11月21日，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所Per Uhlén在Science杂志发表研究论文“Whole-brain spatial transcriptional analysis at cellular resolution”，提出了全脑空间转

2024年11月21日，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所Per Uhlén在Science杂志发表研究论文“Whole-brain spatial transcriptional analysis at cellular resolution”，提出了全脑空间转录组分析技术结合了高通量测序和先进的成像技术，能够在保持细胞空间位置信息的同时，全面解析基因表达模式。

最近的RNA分析进展加深了对生物组织中细胞状态的理解。TRISCO（Tris buffer-mediated retention of in situ hybridization chain reaction signal in cleared organs）是一种新型的组织透明化技术，专为整个大脑的空间三维RNA成像设计。该方法解决了几个关键问题，包括保持RNA完整性、实现均匀的RNA标记以及提高组织透明度，在不同大小和物种的多种器官中测试了TRISCO技术。结果显示，TRISCO能够作为强大的工具可用于单细胞水平、全脑范围的3D成像，从而实现对整个大脑的全面转录组空间分析。

1. 将isHCR和iDISCO技术结合可以提升对生物组织中细胞状态和功能的理解

现有的组织中RNA成像仅限于超薄切片或仅有几毫米厚的样本，存在探针穿透不均匀、RNA完整性受损、信号强度低以及透明化处理后组织透明度降低。为了实现全脑成像，首先解决了原位杂交实验中核糖核酸酶污染和RNA降解的影响。分析显示，在5×SSCT中孵化的大脑中心透明度差。此外，在评估大脑内部区域与大脑外部区域之间的信号强度比时，发现与用水洗涤的大脑相比，用5×SSCT处理的大脑透明度明显降低。用针对谷氨酸脱羧酶1（Gad1）mRNA的内部设计的DNA寡核苷酸探针对新生小鼠大脑进行染色，并随后进行组织透明化。Gad1 isHCR染色主要观察到在大脑表面，包括大脑皮层和纹状体等区域，而较深的区域如丘脑几乎无染色。通过优化清洗方法和缓冲液浓度，特别是使用500 mM Tris-HCl缓冲液，成功地结合了isHCR与有机溶剂组织透明化技术，实现了对全脑的高分辨率、高灵敏度的三维RNA成像。

2. 全脑多重TRISCO染色

作者接下来使用完整的TRISCO流程对整个小鼠大脑进行了3D成像。TRISCO的细胞分辨率揭示了Pvalb、Gad1和Sst在海马神经元中重叠和独特的表达模式，还设计了针对不同细胞类型表达的转录本的基因探针，包括针对星形胶质细胞的Mfge8 mRNA和Aldoc mRNA，针对小胶质细胞的Csf1r mRNA和Hexb mRNA，以及针对少突胶质细胞及其前体的Sox10 mRNA和Pdgfra mRNA。上述细胞类型的转录本表达在使用TRISCO时很容易被检测到。作者还使用共聚焦显微镜进行了定量分析，在纹状体中检测到的Csf1r阳性细胞的百分比在2D和3D方法之间几乎相同，表明TRISCO可以实现整个区域的无偏覆盖。此外，分析了与神经递质相关的RNA转录本的表达，这些神经递质涉及更高级的大脑功能，包括多巴胺、血清素和乙酰胆碱：Th、Slc18a2、Slc6a3、Tph2、Ddc、Maoa、ChAT、Slc13a3和Ache。TRISCO揭示了深脑结构中特定的基因表达模式。

3. 利用c-Fos进行大型啮齿动物全脑TRISCO分析和神经元活动研究

为了扩展TRISCO的潜在应用，在啮齿动物和人类的各种组织上进行了3D成像实验。作者探索了TRISCO在更大大脑（如大鼠和豚鼠的大脑）上进行完整组织转录分析的能力。TRISCO能够轻松地在大鼠大脑中可视化Th mRNA，在豚鼠大脑中可视化Sst mRNA。这些大脑的光学横截面揭示了Th mRNA和Sst mRNA的特征性表达模式，以单细胞分辨率呈现。作者还对人类胎儿大脑半球（受孕后12.5周）进行了TBR2 mRNA的染色，TRISCO成功检测到人类胎儿大脑深处的空间结构。同时进一步测试了TRISCO在大脑以外的器官上的多功能性。在小鼠脊髓的完整胸段，对ChAT mRNA进行了染色，还对心脏、肾脏和肺等中枢神经系统以外的完整器官进行了染色，TRISCO均检测到具有器官典型空间分布的组织特异性RNA转录本。接下来还成功利用c-Fos评估了TRISCO检测全脑功能神经活动的能力。以上数据表明TRISCO是一个强大的工具，可以全面评估全脑中的细胞、非编码RNA表达以及活动调节的基因转录，并且也可以用于其他器官。

Summary

TRISCO克服了传统RNA成像技术的限制，如样本厚度限制、探针穿透不均匀、RNA完整性受损、信号强度低和组织透明度不足。TRISCO不仅适用于小鼠大脑，还可以扩展到大鼠、豚鼠等大型啮齿动物的大脑，甚至人类胎儿大脑。TRISCO成功检测了与神经递质相关的RNA转录本，如多巴胺、血清素和乙酰胆碱，以及在特定脑区的c-Fos mRNA表达。总的来说，TRISCO技术为神经科学研究提供了一种新的、高分辨率的全脑空间转录组分析方法，有助于深入理解大脑结构和功能。