摘要：在生物技术与分子生物学中，原核蛋白表达体系（尤其是大肠杆菌蛋白表达）因操作简便、生长速度快、成本低廉，是获取重组蛋白的重要途径。然而，在高水平表达时，目标蛋白往往以包涵体蛋白形式沉淀，形成不可溶的聚集物。这种现象虽影响生物活性蛋白得率，但其高表达量、易纯化等特
在生物技术与分子生物学中，原核蛋白表达体系（尤其是大肠杆菌蛋白表达）因操作简便、生长速度快、成本低廉，是获取重组蛋白的重要途径。然而，在高水平表达时，目标蛋白往往以包涵体蛋白形式沉淀，形成不可溶的聚集物。这种现象虽影响生物活性蛋白得率，但其高表达量、易纯化等特性使得包涵体蛋白纯化成为不可忽视的技术路线。因此，在工程过程中，提升可溶性蛋白表达与完善包涵体蛋白的纯化与复性策略，是实现高效、活性蛋白回收的关键。
可溶性蛋白表达策略
避免目标蛋白形成沉淀、提高可溶性表达是首选路径。文献指出，通过优化表达条件可有效提升可溶性蛋白表达：
1、降低培养温度，例如降至 20–30 °C，能减缓表达速度，提升折叠效率，减少包涵体形成。
2、调整诱导条件：如降低 IPTG 浓度（如 0.1 mM 诱导），或在较低细胞密度时诱导，可显著减少非溶性聚集。
3、使用融合标签（如 MBP、GST、His-tag）：这些标签可增强表达稳定性、促进折叠并便于后续纯化。
4、伴侣蛋白共表达：如 DnaK–DnaJ–GroEL/ES 蛋白折叠体系，以及过氧化还原系统 DsbA/DsbC 可改善折叠，尤其针对含多二硫键蛋白。
5、培养添加剂优化：如渗透保护剂（甘氨酸-甜菜碱、山梨醇）、乙醇、维生素（如硫胺素、核黄素）、辅因子等，有助于提高可溶性表达。
6、低温适应菌株：如 ArcticExpress 系统携带冷适应伴侣，可在极低温下表达提高可溶性。
通过上述策略，可显著在原核蛋白表达 / 大肠杆菌蛋白表达系统中提升可溶性蛋白表达比率，从而降低进入包涵体途径的蛋白量。
包涵体蛋白纯化流程
当可溶性表达不足时，包涵体表达成为高产获取目标蛋白的重要替代。常见包涵体蛋白纯化流程分为四大步骤，基于多个综述与研究：
（1）包涵体分离与纯化
表达后，裂解大肠杆菌细胞（机械裂解如超声或 French press；化学方法如 lysozyme）以避免损伤可溶蛋白，并减少包涵体破碎。
通过离心法收集密度较高的包涵体 pellets，进一步洗涤去除宿主蛋白、RNA、膜片段等杂质。常用洗涤液含有去污剂如 Triton X-100 或脱氧胆酸，以增强纯度。
可选用密度梯度离心（如蔗糖梯度）或膜过滤技术进一步纯化。
（2）蛋白溶解（Solubilization）
传统方法利用高浓度变性剂（如 6–8 M 尿素或 Guanidine-HCl）及还原剂（DTT/TCEP）彻底展开蛋白结构。
更优策略是温和溶解，保留部分蛋白结构，减轻折叠难度。如采用较低浓度尿素、有机溶剂（n-丙醇、DMSO）、轻型去污剂（N-lauroylsarcosine）、弱碱性 pH 等。
研究亦指出，有些“非经典包涵体”（non-classical IB）中蛋白态结构较好，甚至具有部分活性，可在无需强变性条件下直接溶出活性蛋白。
（3）复性（Refolding）
溶解后需进行复性，将蛋白恢复至天然构象。缓慢稀释、梯度透析、加入辅因子、氧化还原系统、辅侣蛋白等方式可降低聚集，提升折叠质量。
有的研究报道采用温和溶解即可保留原有二级结构，缩短或跳过复性过程，提高生物活性回收率超 40 %。
（4）纯化与活性评估
可溶化或复性后的目标蛋白通常还需进一步纯化：亲和层析（如 His-tag、GST-tag、Strep-tag）是高效手段。
后续可结合离子交换、凝胶过滤进一步提升纯度与去除聚集体。
最后利用 SDS-PAGE、活性测定、CD 光谱等评估蛋白纯度与结构完整性。
研究趋势与应用
近年来研究指出传统高变性溶解并非唯一路径，一些微环境条件下包涵体具有生物活性，可通过溶出活性蛋白的“自发性溶解”或“非变性方法”回收，在保留活性方面更具优势。2024 年发表论文提出，可考虑“排除强变性协议，采用温和或自发溶解策略”以广泛适用各种蛋白。此外，包涵体中蛋白非晶态结构、结构异质性亦逐步被认识，有助支持温和处理策略。
大肠杆菌蛋白表达体系在现代生物制药与结构生物学研究中依然占据核心地位。面对蛋白质易形成包涵体的问题，可以通过优化可溶性蛋白表达条件来尽量避免不溶性聚集；而在难以避免包涵体生成时，系统化的包涵体蛋白纯化与复性流程则为获得活性产物提供了可靠途径。随着研究不断深入，从传统的强变性复性方法逐步发展到温和溶解乃至直接获得具有部分活性的包涵体，技术路径日益多样化与精细化。未来，通过结合分子伴侣工程、新型表达菌株以及智能化纯化平台，将有望进一步提升蛋白产量与活性恢复率，从而更好地满足科研与产业对高质量重组蛋白的需求。
来源：积极的辰小创
