摘要：背景：尿素是反刍动物营养中重要的非蛋白氮源，但由于瘤胃中快速的脲酶活性，其有效利用常常受到阻碍。
生科云网址： https://www.bioincloud.tech
编译：微科盟 洒脱点，编辑：微科盟居居、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。
导读
背景：尿素是反刍动物营养中重要的非蛋白氮源，但由于瘤胃中快速的脲酶活性，其有效利用常常受到阻碍。本研究探讨大蒜素作为尿素酶抑制剂提高尿素氮利用率的潜力。研究者利用酶抑制动力学和分子对接技术研究大蒜素与脲酶的相互作用位点。此外，研究者进行宏基因组和15N-尿素代谢通量分析，以评估大蒜素对微生物种群和尿素-N代谢的影响。50为126.77 ± 1.21 μM。分子对接研究表明，大蒜素与尿素酶关键残基形成氢键，导致尿素酶活性位点的抢占，从而阻碍尿素结合。在模拟瘤胃环境中，大蒜素显著降低尿素水解和氨生成。此外，大蒜素通过抑制Prevotella而促进Ruminobacter种和Denitrobacterium detoxificans的生长来改变瘤胃微生物群落。15N-尿素代谢通量分析表明，大蒜素促进尿素衍生的氮纳入微生物的氨基酸和核苷酸。结论：大蒜素有效抑制瘤胃脲酶活性，促进尿素- N转化为微生物量的转化。这些发现表明，大蒜素具有显著的优化瘤胃尿素代谢的潜力，为改善反刍动物氮营养提供了新的策略。
论文ID
原名：Allicin enhances UreA-N conversion to microbial-N by inhibiting urease activity and modulating the rumen microbiome in cattle
译名：大蒜素通过抑制脲酶活性和调节牛瘤胃微生物组来促进尿素氮向微生物氮的转化
期刊：Microbiome
IF：12.7
发表时间：2025.5
通讯作者：王加启，赵圣国
通讯作者单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
DOI号：10.1186/s40168-025-02111-z
实验设计
结果
1 大蒜素的抑制作用
50= 126.77 ± 1.20 μM（图1A，R2 = 0.976）。米氏动力学分析表明，随着大蒜素浓度的增加，瘤胃细菌脲酶的Km和Vmax均降低（图1B）。具体而言，随着大蒜素浓度从125 μ M增加到500 μM，Km从1.601 mM降低到1.382 mM，Vmax从17.47 mM/min降低到16.13 mM/min。这些结果表明，大蒜素通过降低底物亲和力（Km）和最大反应速度（Vmax）对脲酶活性产生抑制作用，导致稳定的Vmax/Km比值为11.26 ± 0.312。图1.大蒜素抑制瘤胃细菌尿素酶的动力学参数及结合模式。A大蒜素浓度对瘤胃细菌脲酶残留活性的影响。B在无（黑色●）和添加125 mM（红色■）、250 mM（绿色）和500 mM（蓝色）大蒜素的情况下，残余脲酶活性对尿素浓度的图。方程为Michaelis-Menten模型[Y = Vmax·X/（Km + X）]，其中Y为反应速率，X为底物浓度。数据表示为平均值± SEM。C大蒜素-瘤胃尿素酶蛋白对接的二维和三维图。D尿素-大蒜素-瘤胃脲酶蛋白对接的二维和三维图，浅黄色虚线代表氢键。脲酶基因可分为结构基因UreA（粉红色）、UreB（浅蓝色）和UreC（深蓝色），活性位点位于UreC。
2 分子对接
分子对接和MM-GBSA分析显示，大蒜素与尿素酶结合，与尿素和尿素酶形成三元复合物（图1C，D）。大蒜素与尿素酶活性中心Ni离子连接的H23731336相互作用。相反，尿素与脲酶的残基ALA12241220和GLU1252形成氢键。大蒜素-尿素酶复合物的XP GScore为−3.137，MM-GBSA值为1.68 kcal/mol，表明稳定结合。三元复合物（大蒜素-尿素酶-尿素）的自由能甚至更低，XP GScore为−3.315，MM-GBSA值为−2.490 kcal/mol（参见附加文件1）。这表明大蒜素可能通过反竞争机制抑制脲酶活性，如酶动力学数据所支持的。3 瘤胃发酵的变化
在瘤胃发酵期间，尿素含量随时间降低，其中1-mM、2-mM和4-mM大蒜素组在发酵的2和4小时显示出比对照组显著更高的尿素水平（p3-N水平增加，大蒜素处理组在2小时显示出显著较低的NH3-N水平（p这表明大蒜素降低瘤胃尿素的降解速率。此外，在2和4小时，4-mM大蒜素组的气体产生显著较低（p图2. 大蒜素对体外瘤胃尿素氮相关发酵参数的影响。与尿素氮相关的发酵参数包括尿素（A）、氨氮（B）、产气量（C）和挥发性脂肪酸浓度（D）。数据表示为平均值± SEM。发酵24小时的总挥发性脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸（E）。数据表示为平均值± SEM。✽、a和b表示在该时间点未使用的治疗之间的差异的显著差异（p。
4 瘤胃细菌群落组成
大蒜素影响瘤胃发酵中的微生物多样性，尽管在属水平上在各组之间没有观察到香农指数的显著差异（p> 0.05）（图3A）。然而，β-多样性分析显示大蒜素处理组和对照组之间在属水平上的显著差异（pPrevotella sp.是最突出的，但其相对丰度随着大蒜素处理而降低，而RC 9 sp.和Ruminophylla sp.则增加（图3C、D）。
图3. 瘤胃微生物群落组成。A属级α多样性香农指数图。B大蒜素对瘤胃细菌属级结构的影响。在图例中，OmM代表对照，2mM、4mM和8mM代表大蒜素的剂量。C.在物种水平上，瘤胃微生物区系的前20个相对丰度。D四组的LEfSe分析。x轴表示LDA分数，即，不同细菌属的影响程度。y轴表示各组之间差异显著的细菌。
宏基因组测序产生总共405.06 Gb的数据（平均值土SD：20.25 ± 2.42 Gb，最大值23.8 Gb，最小值16.7 Gb）。研究者共获得73个瘤胃微生物MAG（完整性平均值± SD：90.13 ± 5.19%；污染平均值± SD：2.12 ± 1.43%）（图4A），其中2个MAG为古细菌，71个MAG为细菌（见附加文件2）。在不同组之间观察到MAG丰度的更显著差异（图4 B）。经PLS-DA分析，MAG.49（D. detoxificans），MAG.37（RC9 sp.），MAG.16（Ruminobacter sp.），MAG.46（Denitrobacterium sp.），MAG.43（RC9 sp.），MAG.72（Bifidobacterium globosum），MAG.42（F082 sp.），MAG.48（RC9 sp.）和MAG.54（UBA 6985 sp.）是变化最大的MAG（图4C）。其中，随着大蒜素水平的增加，MAG.49（D. detoxificans），MAG.37（RC9 sp.）丰度增加，MAG.45（Prevotella sp.）丰度降低（图4D）。
图4.大蒜素对瘤胃细菌相对丰度的影响。A MAG的污染和完整性。B在不同大蒜素浓度下前50个菌株的丰度变化。C根据PLS-DA分析的VIP值的前15个物种。D大蒜素对靶细菌菌株相对丰度的影响。
5 尿素氮代谢通量
15 N标记。值得注意的是，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）和N-乙酰基-L-天冬氨酸中发现了50%的15 N标记分子（图5A）。这些代谢物参与嘌呤代谢、氨再循环和尿素循环等途径（图5 B）。有人认为，15 N15 N-尿素参与微生物的生长和代谢，例如，通过谷氨酰胺代谢的嘌呤代谢或次黄嘌呤代谢，通过谷氨酸-精氨酸代谢的天冬氨酸代谢，以及通过β-丙氨酸代谢的氨基糖代谢和嘧啶代谢（图6）。图6.尿素氮转化为微生物氮的主要代谢途径。AMP，腺苷5′-一磷酸；GMP，鸟苷5′-一磷酸; NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； UDP-GlcNAc，尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺；UMP，尿苷5′-一磷酸 。
大蒜素提高尿素氮的利用效率和游离微生物氮（pp（图7A）。含15 N代谢物的非靶向代谢组学谱显示大蒜素和对照组之间存在明显差异（图7 B）。PLS-DA分析揭示大蒜素改变的12种代谢物，其参与氨基酸代谢、氨基糖代谢、尿素循环、嘧啶代谢、微生物代谢和其他途径（图7 C、D）。大蒜素促进尿素-15 N流入尿苷5′-单磷酸（GMP）、UDP-GlcNAc、腺苷5′-单磷酸（AMP）、尿苷5′-单磷酸（UMP）、L-丙氨酸和鸟苷（图7 E、F、G、H、I、J）。讨论
瘤胃细菌脲酶对于非蛋白氮饲料的利用至关重要，但其高活性也降低了反刍动物对尿素饲料的利用效率。提高尿素氮转化为瘤胃微生物氮的效率对反刍动物营养具有重要意义，可能改善蛋白质合成并减少氮浪费。本研究探讨大蒜素对奶牛瘤胃微生物脲酶的抑制作用及其对体外瘤胃发酵、微生物群落组成和尿素氮代谢通量的影响。
本研究结果表明，大蒜素抑制瘤胃尿素酶活性，导致尿素水解率降低。这种影响是显而易见的，从两个Km和Vmax值随大蒜素浓度的增加而降低，表明大蒜素对脲酶产生反竞争抑制。细菌尿素酶由结构基因UreA、UreB和UreC组成，分别编码α亚基（UreC，含有活性中心）、β亚基（UreB）和γ亚基（UreA）。大蒜素与α-亚基活性中心的氨基酸形成氢键，阻断尿素水解位点。这种抑制减缓了微生物NH3-N的产生，增加微生物尿素的利用，从而改善微生物蛋白质的合成。尿素酶被镍离子激活后，通过打开瓣区来催化尿素，使底物尿素进入活性中心，然后置换活性位点的三个水分子，并在尿素与Ni+结合时关闭瓣区。大蒜素对刀豆尿素酶的灭活是由大蒜素与位于尿素酶活性位点（Cys592）的SH基团之间的反应引起的。在本研究中，在瘤胃尿素酶蛋白活性位点UreC中，大蒜素与ARG 1336和与Ni+2O373形成氢键，占据尿素附着位点，影响尿素的尿素酶水解。此时，尿素可与尿素酶蛋白ALA1224、GLU1220和GLU1252在UreC处形成氢键，形成稳定的三元复合物（大蒜素-尿素酶-尿素）。酶抑制剂有三种典型的抑制类型（竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制），不同类型的Km和Vmax等参数随底物浓度和酶浓度而变化。本研究所获得的动力学数据表明，大蒜素对瘤胃尿素酶可能具有混合型抑制作用。虽然观察到的Km和Vmax随着大蒜素浓度的增加而降低与反竞争抑制一致（如稳定的Km/Vmax比所反映的），但分子对接揭示大蒜素和尿素之间对游离UreC活性位点的直接竞争性相互作用（通过与ARG1336的氢键和与Ni2+连接的H2373）。这种矛盾意味着一种双重约束机制：·竞争阶段：大蒜素最初与尿素竞争游离脲酶的活性位点，通过降低底物可及性来增加Km。
·非竞争性阶段：大蒜素随后与酶-底物（尿素-尿素酶）复合物结合，形成稳定的三元复合物（大蒜素-尿素酶-尿素），阻止产物形成，从而降低Vmax。
这个两阶段模型解释在低底物条件下Km和Vmax的同时降低。然而，需要几个关键的实验来验证这一假设：
·不同底物-底物比的动力学测定：确定观察到的模式是否偏离纯竞争性或非竞争性抑制
·同位素标记研究：确定大蒜素是否优先与游离脲酶或ES复合物结合
·结构分析（例如，冷冻电子显微镜）：观察大蒜素与游离和底物结合的尿素酶状态的相互作用。
本研究的数据不能明确分类的抑制类型。先进的功能测定，如表面等离子体共振，以量化抑制剂结合亲和力的自由和ES结合的尿素酶，是必不可少的，以解决这种机制的模糊性，并推进我们的理解大蒜素的作用模式。
除了抑制尿素酶外，大蒜素还调节瘤胃微生物群落。瘤胃微生物是瘤胃代谢的主要完成者，先前的研究表明大蒜素影响瘤胃微生物的组成。然而，大蒜素调节瘤胃微生物组成的机制目前尚不清楚。根据先前的研究，大蒜素可以通过多种机制调节微生物的生长，例如改变其细胞膜的渗透性，抑制其酶活性，干扰代谢过程，以及改变其遗传物质。大蒜素对瘤胃微生物组成的调控机制有待深入研究。值得注意的是，Ruminococcus albus和Prevotella sp. R. albus被证明是一种尿素分解细菌。因此，Patra等人发现大蒜精油可以减少R. albus。已经证明R . albus是一种能够以尿素为唯一氮源生长的尿素利用菌，这充分说明R . albus中的一些物种具有分泌脲酶的能力。作为一种脲酶抑制剂，大蒜素可能通过抑制该酶的活性，限制其氮源的利用，从而抑制R. albus的生长。因此，大蒜素可能会影响R.albus，减少尿素酶的分泌，减缓尿素的降解速率。
Prevotella sp.是瘤胃微生物的优势属，具有降解碳水化合物和蛋白质的能力。特别是，它对肽和氨基酸的脱氨基作用有重要贡献。大蒜素降低瘤胃内Prevotella（Prevotella sp.，MAG.45）的相对丰度，这可能是提高瘤胃微生物对尿素氮利用率的原因之一。Prevotella属物种（MAG.45）具有丰富的氨同化基因，包括转氨酶（ROCD、ASPC、DAPL）、脱氨酶（TADA、AGUA、ADE、GUAD）、肽酶（DPP、PEPP、CTPA、PEPO、PEPD）和氨基酸脱/转氨酶（ANSA、PYRB、LYSC、RPRX）。减少Prevotella sp.的数量可以减少氨基酸和肽降解过程中产生的氨的量。瘤胃环境中来自氨基酸和小肽源的氨减少可能促使瘤胃微生物利用尿素氮降解产生的氨。这表明大蒜素可以提高瘤胃周围氨基酸和小肽的含量，而不降低瘤胃微生物蛋白质的产量，这有利于反刍动物对营养物质的消化。
代谢通量分析（MFA）能够通过量化代谢物产生和消耗的速率来揭示代谢途径的动态变化。在研究尿素氮在反刍动物瘤胃内的分布时，MFA可以利用同位素标记追踪尿素氮的代谢通量，识别关键代谢节点和途径，为优化尿素氮利用效率、减少氮排放提供理论支持。研究者提出的代谢途径表明，尿素-N水解为NH3-N，然后参与关键的代谢过程，包括氨基酸代谢，嘌呤代谢和氨基糖代谢。这些途径对于微生物蛋白质、核苷酸和其他细胞组分的合成是必不可少的，强调氮的有效利用在瘤胃微生物生长和活性中的重要性。氨基酸代谢在微生物蛋白质的合成中起着至关重要的作用，微生物蛋白质是宿主反刍动物膳食蛋白质的重要来源。嘌呤代谢有助于核苷酸的产生，核苷酸是负责微生物生长和增殖的DNA和RNA的重要组分。氨基酸糖异生强调其在糖蛋白、糖脂和肽聚糖等重要细胞成分生物合成中的作用。本研究提出的尿素在瘤胃微生物中的代谢途径和转化过程，突出尿素在瘤胃生态系统氮利用和微生物活性形成中的重要性。大蒜素对尿素氮利用的促进作用，进一步得到了参与硝基化合物代谢的D. detoxificans相对丰度增加的支持。据以往研究表明，D. detoxificans可代谢硝基化合物，也可能在减少瘤胃甲烷产生中发挥作用。值得注意的是，D. detoxificans还拥有肽酶基因（FRVX）、氨基酸ABC转运蛋白基因（TCYB）、天冬氨酸转氨酶基因（PYRB）、氨基转移酶基因（ALATA）、谷氨酰胺合成酶基因（GLNA）以及将谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨的基因（PDXT）。具备完整的氮利用循环能力。因此，D. detoxificans相对丰度的增加也可能是大蒜素提高尿素氮利用的另一个因素。
在本研究中，在每个65 mL培养系统中，将DMSO浓度小心控制在0.1%，低于观察到对细菌生长具有显著抑制作用的阈值（0.5 -1%）。该方法将DMSO对瘤胃尿素氮代谢的潜在影响降至最低，并确保观察到的任何影响主要是由于供试化合物而非溶剂所致。瘤胃模拟系统是反刍动物营养研究中广泛应用的实验方法。与动物试验相比，它有几个优点，包括简单、成本低、结果快，而且没有动物福利问题。在许多综述文章中，已将其推荐为瘤胃模拟研究的优秀工具。该系统不仅可用于测定饲料的瘤胃降解率，还可用于模拟瘤胃微生物的氮代谢。在该系统中维持的厌氧条件确保了瘤胃微生物的适当生长，使正常发酵和可靠的氮代谢模拟成为可能。然而，由于本研究采用的是分批培养系统，未来的研究可能会受益于使用连续培养系统或瘘管动物来验证大蒜素的作用。该方法将为指导新型饲料添加剂的开发提供更有力的见解。
大蒜素通过改善瘤胃微生物多样性和调节微生物组以培养更高效和健康的瘤胃生态系统，显著提高反刍动物的健康和生产力。这一发现不仅为反刍动物饲养业提供了一种新的调控策略，同时也为实现农业生产的绿色高效发展提供有力支撑。虽然本研究结果强调大蒜素处理对微生物多样性的潜在益处，但考虑与这些变化相关的潜在长期生态风险是至关重要的。如大蒜素处理所观察到的，较少优势微生物物种的出现可能影响瘤胃生态系统的稳定性。虽然瘤胃杆菌和RC9丰度的增加可能会增强特定的代谢功能，但这些变化的长期后果仍不清楚。长期监测对评估其对瘤胃健康和动物性能的影响至关重要。微生物群落的微小变化可显著改变生态系统的功能，尤其是当优势种和次优势种之间的平衡被破坏时。未来的研究应侧重于长期研究，以评估连续大蒜素处理下瘤胃微生物的稳定性和恢复力。这将有助于深入了解其对瘤胃健康和养分利用的长期影响。在瘤胃之外，微生物多样性的变化可能会产生更广泛的生态影响，例如改变温室气体排放和消化效率。虽然大蒜素处理可能会改善纤维降解和固氮作用，但它也会影响甲烷产量和其他发酵副产物。平衡提高的养分利用率和生态稳定性对反刍动物的可持续生产至关重要。
结论
综上所述，大蒜素对瘤胃尿素酶活性具有抑制作用，降低尿素的快速水解，提高尿素氮的利用效率。通过调节瘤胃微生物群落，大蒜素促进微生物蛋白质合成和氨基酸代谢。这些发现突出大蒜素作为尿素酶抑制剂的治疗潜力，并表明尿素饲料在支持瘤胃微生物代谢和蛋白质合成中起着至关重要的作用。此外，研究者发现尿素氮参与重要的生命过程，如瘤胃微生物氨基酸，嘌呤和嘧啶代谢，表明尿素饲料对瘤胃代谢和微生物蛋白质合成的重要营养功能。未来的研究应探索大蒜素作为饲料添加剂在反刍动物营养中的体内应用，以充分研究其对生产性能、生长代谢和畜产品品质的益处。
微科盟更多推荐
微科盟智能客服WekeAI限额体验网址https://www.bioincloud.tech/mini/wekeai/
高引
iMeta工具
iMeta综述
高引
来源：微生物组
