摘要：IVT（In Vitro Transcription）作为 mRNA 生产工艺中最核心的步骤，良好的 IVT 体系既可以提高产量，减少物料用量，降低生产成本，也可以保证 mRNA 分子完整度、加帽率、dsRNA 杂质掺入等核心质量指标的表现，降低下游纯化工艺难

IVT（In Vitro Transcription）作为 mRNA 生产工艺中最核心的步骤，良好的 IVT 体系既可以提高产量，减少物料用量，降低生产成本，也可以保证 mRNA 分子完整度、加帽率、dsRNA 杂质掺入等核心质量指标的表现，降低下游纯化工艺难度，在整个工艺环节起着承上启下的作用。

IVT 反应整体过程较为简单，标准的 IVT 体系主要包含 DNA 模板、T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase 抑制剂及反应 buffer 等组分。

DNA 模板作为 mRNA 转录的模板，一般为 PCR 产物或线性化质粒，包含了 T7 启动子、5’UTR、CDS、3’UTR 和 Poly（A）等原件；NTP 作为 mRNA 转录底物，可以通过替换为修饰核苷酸，达到对 mRNA 进行修饰，提高稳定性、免疫原性等目的；无机焦磷酸酶和 RNase 抑制剂作为辅助组分，无机焦磷酸酶可以水解转录过程中产生的大量的焦磷酸，提高反应效率，RNase 抑制剂则是抑制可能存在的 RNase 酶污染；而 T7 RNAP 作为整个反应体系中的核心酶，负责识别 DNA 模板并将模板转录为 mRNA。除了上一期所讲到的质粒模板的质量外，主要影响 IVT 效果的组分为 T7 RNAP 和 buffer 体系。

T7 RNA聚合酶对IVT体系的影响

在 IVT 体系中，T7 RNAP 识别 T7 启动子序列，结合到 DNA 模板后催化 5’ 端至 3’ 端方向的 RNA 合成。相较于其他 RNA 聚合酶，T7 RNAP 具有高度特异性识别 T7 启动子序列，不需要额外的蛋白或辅助因子即可完成转录等特点，这使 T7 RNAP 成为了体外转录生产 mRNA 的不二之选。T7 RNAP 在结构上类似于捧着的右手，包括了一个 N 端结构域（1-312 氨基酸）和一个 C 端结构域（313-883 氨基酸），C 端结构域进一步细分为拇指（氨基酸 330-410）、手掌（氨基酸 411-448、532-540、788-838）和手指（氨基酸 541-737、771-778）亚结构域，DNA 模板结合在亚结构域之间的间隙。

UBC Anna Blakney Lab 采用 DOE 方法探索 IVT 反应中各个反应参数如何影响常规 mRNA 与 saRNA 的产量和质量（完整转录本比例），发现温度对长片段 saRNA 的完整度有显著影响[1]。随着温度从 20℃ 上升至 42℃，saRNA 产量虽然也会增加，但是，saRNA 完整度在温度超过 32℃ 时急剧下降。对于优化 saRNA 的完整度，定向筛选低温转录的 T7 RNA 聚合酶可能是新的研究方向。

Wu 等报道了T7 RNAP 热稳定突变体在高温条件下转录，可以减少由 3’ 端过度延伸导致的 dsRNA；模板编码 poly（A）尾对 3' 端过度延伸无影响，但能够减少短链互补 RNA 的产生[2]，且高温 IVT 的产物转染细胞的免疫原性较低。

瀚海新酶基于荧光信号的荧光激活液滴分选技术（fluorescence-activated droplets sorting, FADS）结合酶定向进化平台，筛选出多种 T7 RNA 聚合酶突变体，包括耐热型、高比活型、低 dsRNA 型等。

FADS 技术是目前主流的微流控筛选技术，通过设计不同的荧光探针或者酶级联反应来直接或间接实现目标酶基因型与荧光的耦联，处理微液滴的分选通量高达 5000个/s，同时通过配置的高速相机，能够实现分选的可视化[3]。

瀚海新酶利用上述平台，通过逐步提升温度筛选压力，对 T7 RNAP 的耐高温性能进行定向进化，最终获得目标突变体 M16（货号：HBP000350），在 52℃ 下半衰期提高 270 倍，催化活性提升 58 倍。

在 10mM NTP 的终浓度体系、37℃ 和 50℃ 反应温度下，M16 使用不同长度的 DNA 模板，1μg 模板转录产物均能高于 150μg，并且转录产物中 dsRNA 含量显著降低，而 T7-WT 则在 50℃ 下难以转录，产物少于 10μg。与此同时，50℃ 的高温环境，对 mRNA 的完整度产生影响，相较 37℃ 产物完整度有显著降低。

耐高温的 T7 RNAP 在 50℃ 下可以更高效地合成 circRNA[4]。瀚海新酶耐高温突变体 M16 以卓越的耐高温性能，可应用于 circRNA 高效合成。

除了提高耐热性，增加 T7 RNAP 转录产物 3’ 端一致性，以减少转录副产物 dsRNA 的改造方向也持续受到关注。G47A + 884G 的突变体报道，表现出该突变体显著降低 dsRNA 至 0.02%（w/w）以下[5]。

然而该酶存在酶活偏低的现象，导致其在工业端应用具有局限性。瀚海新酶结合考虑 3’ 端一致性与酶比活性，筛选减少产物 dsRNA 的突变体。将转录产物的 3' 端是否过度延伸作为3’端一致性的指标，通过 RNase T1 对碱基 G 后的序列进行切割，在特定检测模板下，分别会产生分子量为 9663-OH 结尾的同质性产物和分子量为 9743-mP 结尾的异质性产物。

通过这该方法检测不同突变体转录产物 3’ 端一致性，发现 M13、M14 突变体表现出显著优于野生型 T7 RNAP。M14 突变体的比活相较野生型 T7 RNAP 下降约 14 倍，IVT 产量较低，不适合产业化应用。M13 则具有与野生型 T7 相近的产量及高比例的 3’ 端一致性，因此，M13 作为筛选的第一代 T7 RNAP（low dsRNA 货号：HBP000340）。

同时，耐高温突变体M16在高温下也展现相对于野生型更高的转录产物 3’ 一致性，与耐高温突变体 M16 产物 dsRNA 检测结果相符，展现出 3’ 一致性与 T7 RNAP 转录产物中 dsRNA 的相关性。

对所筛选 T7 RNAP（low dsRNA）反应体系进行进一步优化后，在不同长度及加帽方式的模板下，转录产物 dsRNA 含量可低至 0.005% 以下，相较野生型降低了 50% 以上。

瀚海新酶基于 FADS 技术同时也突变并筛选出了 T7 RNAP 突变体M6（货号：HBP000330），相较于野生型酶，在比活力、转录产量和产物完整度上表现出了优秀的性能。

Buffer对IVT体系的影响

拥有高性能的酶很关键，但仅仅拥有高性能的酶是远远不够的。为了将酶的性能高效的发挥出来，并且适配不同的模板，反应 buffer 的优化同样至关重要的。IVT buffer 通常包含多种成分，如盐类、pH 缓冲剂、二价阳离子、还原剂等。这些成分的浓度和比例直接影响 RNA 聚合酶的活性、特异性和稳定性，以及 RNA 的质量和功能。

Rosa 等用贝叶斯优化方法对 12 个不同参数优化IVT反应，有效提升 mRNA 的产量[6]。其中，pH 与镁离子对 IVT 反应影响程度最为显著。

●pH值及缓冲剂选择

大多数 RNA 聚合酶在接近中性或略偏碱性的环境中活性最高，而 RNA 则是在中性或偏酸性环境中更稳定，并且在转录过程中会有氢离子的形成与积累，需要缓冲盐稳定反应溶液的 pH 以防止过低的 pH 影响 T7 RNAP 与 DNA 模板的结合，而部分缓冲剂可能导致 RNA 降解[8]。

因此，合适的缓冲剂及 pH 的选择也会影响最终 IVT 产物的质量。Rosa 等[6]的研究表明 pH 在 6.5-7.2 的大范围内，均可提升转录效率。Kern & Davis[9]早在 1997 年的研究中也报道称 pH 在 7.0-7.5 之间会提升转录速率。但也有研究表明 T7 RNAP 在更高的 pH 7.9 和 8.0 的 buffer 中，IVT 转录产量表现较优[10,11]。

●Mg2+浓度选择

T7 RNAP 与 DNA 模板的结合需要 Mg2+ 的参与[12]，合适的镁离子浓度可以促进聚合酶的活性，但过高的浓度可能导致非特异性结合和副产物的形成。Rosa 等推荐 Mg2+浓度为 40-60mM 提升 mRNA 合成产量[6]。

75mM 镁离子和各 10mM NTPs 搭配可以实现 RNA 的最高产量[13]。镁离子的增高提升产量也需要 NTPs 底物浓度的足够高为基础，7mM 以上 NTPs 才能够使 IVT 反应产量在较高水平[14]，过高的 NTPs（20mM）反而会抑制 mRNA 的产量[13]。市面上的高产体外转录试剂盒的 NTPs 推荐常为 8mM 和 10mM。

实现高产量与高完整度所需的最佳 Mg2+浓度是不相同的，并且，合成不同长度 mRNA （常规线性 mRNA 与 saRNA ）所需的最佳 Mg2+浓度也是不相同的[1]。瀚海新酶的高产 T7 体外转录试剂在 1000nt-5000nt 下与多个市售竞品相比产量与完整度均具有优势。

但同一 Buffer 体系下 340nt 片段完整度仍具有优势时，产量水平不具优势，同时竞品 V 产量相对较高，但完整度低于其他竞品。若针对特定模板进行针对性优化筛选，可以获得高产量、高完整度的 mRNA。针对不同片段长度的定制化优化，镁离子浓度是关键性因素之一。

不同长度片段（340nt-5000nt）在市售试剂盒产量与完整度

瀚海新酶发现 2000nt 长度 mRNA 转录体系中镁离子浓度在 20mM-30mM 的梯度调整中，副产物 dsRNA 随镁离子浓度升高而升高，而另一 4000nt 长度的 mRNA 则没有此现象。dsRNA 含量随镁离子浓度降低而降低的结果与 Popova 等[1]对1500nt mRNA 和 saRNA 的 DoE 优化中的结果趋势一致。

含镁的无机盐阴离子类型不同，也会对于 IVT 反应产量起到重要的作用，在多个研究中更为推荐醋酸根离子优于氯离子[6,9,13]。氯离子会和 DNA 竞争与 T7 RNAP 特定蛋白位点结合是影响转录产量的原因[9,15]。

●其他添加剂

近期，部分友商报道将可降低 Cap1 投料量作为特定突变体 T7 RNAP 的特性。在共转录体系中，以 10mM 终浓度的 NTP 投料为例，Cap1 的投料终浓度从 8mM 降低至 1mM，相对较短的片段（1000nt~），长片段的产量与加帽率随 Cap1 投料量的减少而受到影响更明显。接近的 mRNA 产量下，短片段（1000nt~）相对的分子数更多，消耗更多的 Cap1 底物，长片段（4000nt~）相对的分子数更少，消耗 Cap1 更少。Cap1 在共转录体系中占据较大的成本，根据产物的片段长度，可降低 Cap1 的投料量以降低成本。瀚海新酶可在任一 T7 突变体酶反应体系中均能减少至少 50% 的 Cap1 投料量，保持转录产物 97% 以上的加帽率。

瀚海新酶建立了基于 iSpinach 适配体的实时体外转录活性监测方法（STAR），并已申请专利（专利公开号：CN115896213A）。该方法具有操作简单、快速，不受流产片段、dsRNA 等副产物影响的优势，可以快速、定量的评估转录效率，并能兼容修饰核苷酸，可用于 DNA 模板序列的优化，比如启动子、UTR 序列等。

以 mRNA/saRNA 为基础的疫苗和药物同时关注产量、完整度、双链含量等关键质量属性指标，瀚海新酶在上游原料上不断进行迭代更新，提升反应性能，同时探索积累buffer体系优化经验，助力 mRNA 合成在不同项目中快速找到合适的体系，提供高效、经济的体外转录一站式解决方案。

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来源：瀚海新酶