总胆固醇检测试剂盒(比色法检测原理及试剂准备方案

摘要：胆固醇是一种在真核生物中产生并运输到全身的脂质甾醇。胆固醇是细胞膜结构、激素和细胞信号传导中使用的关键化合物。它是动物细胞结构中维持通透性和流动性的必需成分。胆固醇是类固醇激素的前体，包括肾上腺皮质激素（如皮质醇和醛固酮）、性激素（如孕酮、雌激素和睾酮）、胆汁

胆固醇是一种在真核生物中产生并运输到全身的脂质甾醇。胆固醇是细胞膜结构、激素和细胞信号传导中使用的关键化合物。它是动物细胞结构中维持通透性和流动性的必需成分。胆固醇是类固醇激素的前体，包括肾上腺皮质激素（如皮质醇和醛固酮）、性激素（如孕酮、雌激素和睾酮）、胆汁酸和维生素D。胆固醇通过脂蛋白在体内运输，这些脂蛋白具有细胞特异性信号，指导它们运输的脂质到达特定组织。因此，脂蛋白根据其密度在血液中以不同形式存在，包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、中间密度脂蛋白（IDL）和高密度脂蛋白（HDL）。脂蛋白中的脂质含量越高，其密度越低。胆固醇在脂蛋白中以游离醇和胆固醇酯的形式存在，其中胆固醇酯是胆固醇运输和储存的主要形式。

确定循环脂蛋白水平对于诊断脂质运输障碍至关重要。高水平的胆固醇和胆固醇酯（高胆固醇血症）与心血管疾病（如动脉粥样硬化和心脏病）有关，尽管低水平（低胆固醇血症）可能与癌症、抑郁或呼吸系统疾病有关。

艾美捷总胆固醇检测试剂盒(比色法)（#STA-384）是一种简单的比色法检测方法，可在96孔微量滴定板格式中测量血浆、血清、组织匀浆或细胞裂解液中的总胆固醇含量。该检测可在胆固醇酯酶存在的情况下检测总胆固醇（胆固醇酯+游离胆固醇），或在没有酯酶酶的情况下仅检测游离胆固醇。每套试剂盒提供足够的试剂进行多达192次检测，包括空白、胆固醇标准品和未知样本。通过与已知浓度的胆固醇标准品比较，确定样本中的胆固醇浓度。通过从总胆固醇值中减去游离胆固醇值，可以定量胆固醇酯。

总胆固醇检测试剂盒(比色法)检测原理：

Cell Biolabs的总胆固醇检测试剂盒通过酶促反应定量血清、血浆、裂解液或组织样本中的总胆固醇。胆固醇酯通过胆固醇酯酶水解为胆固醇，随后被胆固醇氧化酶氧化为酮类化合物（胆固醇-4-烯-3-酮）和过氧化氢。过氧化氢随后通过高特异性的比色探针检测。辣根过氧化物酶催化探针与过氧化氢之间的反应，二者以1:1的比例结合。样本与已知浓度的胆固醇标准品在96孔微量滴定板格式中进行比较。样本和标准品孵育45分钟后，使用标准96孔比色法酶标仪（见图1）读取结果。

图1：比色法胆固醇检测原理

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总胆固醇检测试剂盒(比色法)组成：

盒子1（室温运输）：

1. 胆固醇标准品（部件编号239001）：一支50 µL管，含10 mM乙醇溶液中的胆固醇。

2. 检测稀释液（5倍）（部件编号239002）：一瓶100 mL。

3. 50倍比色探针（部件编号238401）：一支200 µL管，溶于DMSO中。

4. 辣根过氧化物酶（部件编号234402）：两支100 µL管，含100 U/mL甘油溶液中的辣根过氧化物酶。

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. 胆固醇酯酶（部件编号239003）：一支管，含10单位酶的粉末。

2. 胆固醇氧化酶（部件编号239004）：一支200 µL管。

未提供材料：

1. 96孔微量滴定板

2. 蒸馏水或去离子水

3. 1倍PBS

4. 10 µL至1000 µL可调单通道移液器及一次性吸头

5. 50 µL至300 µL可调多通道移液器及一次性吸头

6. 多通道移液器储液槽

7. 能在540-570 nm吸光度范围内读取的分光光度酶标仪

8. 超氧化物歧化酶（可选）

储存：

收货后，将检测稀释液储存于4°C。其余试剂盒组分储存于-20°C。50倍比色探针对光敏感，必须相应储存。避免多次冻融循环。

试剂准备：

- 1倍检测稀释液：在使用前将检测稀释液（5倍）平衡至室温。用去离子水稀释检测稀释液（5倍），将100 mL稀释液与400 mL去离子水混合，总体积为500 mL。混合均匀。将1倍检测稀释液储存于4°C，最长可达六个月。

- 胆固醇酯酶：用200 µL 1倍检测稀释液重悬粉末。剧烈涡旋直至溶解。分装后储存于-20°C，以避免重悬粉末的多次冻融。

- 胆固醇反应试剂：通过在1倍检测稀释液中稀释胆固醇氧化酶1:50、辣根过氧化物酶1:50、比色探针1:50和胆固醇酯酶1:250来制备试剂。（例如，对于100次检测，将100 µL胆固醇氧化酶、100 µL辣根过氧化物酶、100 µL比色探针和20 µL胆固醇酯酶与1倍检测稀释液混合至5 mL总体积）。混合均匀并避光保存。为获得最佳结果，将胆固醇反应试剂置于冰上，并在制备后30分钟内使用。不要储存胆固醇反应试剂溶液。

注意：

1. 如果仅需要检测游离胆固醇浓度，请从胆固醇反应试剂溶液中省略胆固醇酯酶的添加。

2. 比色探针对光敏感，必须相应储存。

检测步骤：

每次检测时，每个胆固醇标准品和样本均需进行双份或三份检测，并使用新制备的标准曲线。

1. 向96孔微量滴定板中加入50 µL稀释后的胆固醇标准品或样本。

2. 向每个孔中加入50 µL准备好的胆固醇反应试剂，并充分混合孔内内容物。

3. 覆盖孔以保护反应免受光照。在37°C下孵育45分钟。

4. 立即使用分光光度酶标仪在540-570 nm范围内读取结果。

5. 通过将样本吸光度值与胆固醇标准曲线比较，计算样本中的胆固醇浓度。

总胆固醇检测试剂盒(比色法)文献参考：

1. Admundson, D.M., et al. (1999) J. Biochem. Biophys. Meth. 38: 43-52.