Nat Neurosci：内皮细胞TDP-43的缺失破坏核心血脑屏障通路

摘要：内皮细胞（ECs）有助于维持血脑屏障，但在许多神经退行性疾病中会退化。2025年3月14日,康涅狄格大学医学院Patrick A. Murphy在Nature neuroscience杂志发表了“Endothelial TDP-43 depletion dis

内皮细胞（ECs）有助于维持血脑屏障，但在许多神经退行性疾病中会退化。2025年3月14日,康涅狄格大学医学院Patrick A. Murphy在Nature neuroscience杂志发表了“Endothelial TDP-43 depletion disrupts core blood–brain barrier pathways in neurodegeneration”揭示了内皮细胞中TDP-43的缺失会破坏神经退行性疾病中的核心血脑屏障通路。

作者从死后的人类大脑皮层（92名捐赠者，50名男性和42名女性，年龄20-98岁）中分离出内皮细胞和小胶质细胞核，结果显示，转录组和表位的细胞核内索引技术能够以单核分辨率同时分析核蛋白和RNA转录本。在阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶退化症中鉴定出一组与疾病相关的小动脉内皮细胞。这些毛细血管表现出核β-catenin及其下游基因的减少，同时伴有TNF/NF-κB标志物的升高。值得注意的是，这些转录变化与核TDP-43（一种在神经元核中也减少的RNA结合蛋白）的丢失相关。在人类和小鼠内皮细胞中破坏TDP-43会复制这些变化，表明内皮细胞中TDP-43的缺失是导致神经退行性疾病中血脑屏障破坏的重要因素。

图1 人类组织样本的单核分析：内皮细胞和小胶质细胞富集

为了富集在脑组织单核分析中通常代表性不足的内皮细胞和小胶质细胞，作者通过染色ERG转录因子的方法对它们进行了富集。作者鉴定出ERG高表达（ERGHi）和ERG低表达（ERGLo）的细胞核，其丰度在不同条件下没有显著差异。ERGHi细胞核属于内皮细胞，而ERGLo细胞核可能代表了类似ERG的转录因子FLI1，属于小胶质细胞。将细胞核分为四组：内皮细胞（ERGHi）、小胶质细胞（ERGLo）、神经元（NeuN）和其他实质细胞核（ERGnegNeuNneg）。然后，将这些细胞核重新组合，最终比例为50%内皮细胞核、25%小胶质细胞核，以及神经元和其他实质细胞核的混合物。对内皮细胞和壁细胞区室的详细分析能够进一步将其细分为动脉、毛细血管、静脉和反应性毛细血管，以及周细胞、平滑肌细胞和脑膜或血管周围成纤维细。因此，基于ERG的分离方法为高效研究大量脑样本中的内皮细胞和小胶质细胞核提供了一种可靠的方法。

图2 小胶质细胞中的p65/NF-κB与疾病相关的小胶质细胞存在关联

在鉴定出与疾病相关的小胶质细胞转录变化后，作者旨在评估inCITE-seq方法识别核p65/NF-κB改变的能力。在ALS（肌萎缩侧索硬化症）、FTD（额颞叶退化症）和AD（阿尔茨海默病）中观察到小胶质细胞NF-κB信号的水平升高。目前已有大量关于通过单细胞分析在动物模型和人类组织中观察到的小胶质细胞状态的信息；为了研究小胶质细胞亚群中NF-κB蛋白水平，通过计算分离了小胶质细胞核，并在去除批次效应后对其进行了精细聚类。这产生了四个小胶质细胞簇：稳态型、疾病相关小胶质细胞、过渡型和营养不良型，这些簇由特征性基因表达定义。稳态型基因包括CX3CR1和P2RY12；DAM相关基因包括SPP1和TMEM163，同时稳态基因和其他在营养不良型小胶质细胞表型中观察到的基因（如FTL和FTH）下调。对推断的通路分析显示，NF-κB、TNF和TRAIL是差异最显著的通路，其中NF-κB活性在DAM簇中最高。与此一致的是，下游经典的TNF/NF-κB转录靶标在DAM簇中升高。对每个捐赠者核在各簇中的比例分析显示，AD、ALS和FTD患者的核在DAM簇中显著富集。因此，小胶质细胞聚类以及DAM簇在AD、ALS和FTD中的富集。与稳态簇相比，DAM簇中的p65/NF-κB水平升高。此外，观察到p65/NF-κB的前10%高表达主要富集在DAM簇中，而后25%低表达则集中在稳态簇中，这与DAM中经典TNF/NF-κB转录本的正向调控和稳态簇中的下调一致。值得注意的是，作者还检测到一个过渡型簇，其特征是p65/NF-κB水平中等，并伴随TRAIL信号响应。这验证了inCITE方法在AD、ALS和FTD中已充分表征的小胶质细胞激活研究中的有效性。表明存在一个NF-κB中等但TRAIL高表达的过渡型簇，其中激活的通路并非经典TNF/NF-κB响应基因，而是更接近TRAIL信号通路。

图3 不同的脑毛细血管内皮细胞状态与健康衰老和神经退行性疾病相关

作者的转录组数据表明，内皮细胞内的变化与疾病状态密切相关。因此，对脑内皮细胞进行了类似于小胶质细胞分析的研究。通过ERG高表达分离的内皮细胞包括动脉、毛细血管和静脉细胞，这些细胞由已知的标记物明确区分。毛细血管簇在不同疾病状态之间的差异最大。与在小胶质细胞研究中的方法类似，对毛细血管内皮细胞进行了亚聚类分析，并鉴定出五个不同的主要簇。作者在REV1的高表达基因中观察到LDLR；LDLR对ApoE蛋白具有高亲和力，并调节大脑中的淀粉样蛋白水平。这与TAGLN2和CD63的表达一致，这两个基因参与内皮细胞激活后的细胞骨架组织。捐赠者的年龄对这些簇中细胞的贡献影响较小，因为年轻捐赠者和认知正常的年长捐赠者都表现出明显的偏向于稳态型簇（HC），而远离REV1。总体而言，这两个簇占每位捐赠者所有毛细血管内皮细胞的47%，因此构成了毛细血管床的很大一部分。REV1相关的通路包括上皮-间充质转化、G2/M检查点、TNF/NF-κB信号以及Wnt/β-catenin信号减少。相比之下，稳态型簇（HC）以与β-catenin信号增强和脂质代谢相关的基因为特征。因此，对毛细血管内皮细胞群体的分析揭示了在神经退行性疾病中向促炎性毛细血管亚型的转变。这一REV1细胞簇由具有血脑屏障（BBB）功能障碍转录特征的毛细血管内皮细胞组成。

图4 inCITE分析揭示了疾病相关细胞核中Wnt/β-catenin信号的丢失

作者分析并评估这些簇中内皮细胞激活的关键标志物（p65/NF-κB）、屏障功能（β-catenin/Wnt）以及TDP-43的水平。对毛细血管簇中抗体染色强度的量化显示，HC簇中核β-catenin蛋白水平升高，而REV1簇中则降低，这一趋势与TDP-43的变化相似。HC簇中核β-catenin水平较其他簇明显增加。核β-catenin水平与HC簇中β-catenin转录靶标上调的富集相一致。例如，β-catenin信号的关键转录靶标如TCF/LEF1、ABCG2和APCDD1在HC簇中的表达显著高于REV1簇。因此，高度富集AD、ALS和FTD捐赠者的REV1群体表现出TDP-43和核β-catenin水平的降低，以及经典Wnt响应基因表达的减少。

总结

作者展示了在包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶退化症在内的多种神经退行性疾病状态下，近一半的毛细血管内皮细胞表现出独特的转录特征。通过应用inCITE-seq分析TDP-43和关键转录因子，揭示了疾病相关毛细血管内皮细胞中经典NF-κB转录输出的增加并非与核NF-κB水平升高相关，而是与最高NF-κB水平下核TDP-43水平的下降相关。这与涉及TGF-β、免疫细胞招募和凝血相关转录本的表达增加以及内皮屏障功能的关键调节因子β-catenin信号的减少密切相关。内皮细胞中TDP-43核水平的变化足以驱动毛细血管内皮细胞REV1群体中观察到的许多转录改变，这表明内皮细胞中疾病特异性的核TDP-43丢失是导致AD、ALS和FTD中血脑屏障完整性丧失的原因。即使是由于杂合性ALS/FTD相关突变导致的脑内皮细胞中部分TDP-43丢失，也会引发内皮功能障碍和血脑屏障破坏。