摘要：诱导肿瘤细胞铁死亡是一种潜在的抗肿瘤策略。然而，哪些特定类型的癌症对铁死亡诱导剂敏感？最近的一项研究中，中山大学肿瘤防治中心张海亮团队建立了患者来源的CRC类器官筛查模型，以识别对诱导铁死亡治疗敏感的肿瘤，为确定患者来源的肿瘤对诱导铁死亡的治疗敏感提供了一个范
诱导肿瘤细胞铁死亡是一种潜在的抗肿瘤策略。然而，哪些特定类型的癌症对铁死亡诱导剂敏感？最近的一项研究中，中山大学肿瘤防治中心张海亮团队建立了患者来源的CRC类器官筛查模型，以识别对诱导铁死亡治疗敏感的肿瘤，为确定患者来源的肿瘤对诱导铁死亡的治疗敏感提供了一个范例，也为今后临床选择对诱导铁死亡治疗敏感的肿瘤患者提供了理论和方法学依据。
文章介绍
题目：线粒体自噬缺陷肿瘤通过解除对脂质过氧化的抑制而诱导铁死亡的易感性
杂志：Advanced science
影响因子：14.3
发表时间：2024年12月
#1
研究背景
Background
铁死亡敏感性肿瘤的鉴定对于铁死亡诱导疗法在肿瘤治疗中的应用至关重要。然而，肿瘤对铁死亡敏感性的高度异质性极大地限制了目前铁死亡诱导治疗的转化研究。患者来源的类器官（PDO）在新药筛选和药物敏感性研究中发挥着重要作用。研究表明，线粒体自噬缺陷是驱动某些肿瘤恶性进展的重要因素。然而，抑制线粒体自噬缺陷肿瘤生长和转移的方法仍有待研究。在这项研究中，研究人员建立了结直肠癌（CRC）的PDO筛选模型，以识别对铁死亡诱导疗法敏感的肿瘤。重要的是，研究人员发现诱导铁死亡的疗法选择性地抑制了线粒体自噬缺陷的肿瘤生长和转移，为这一亚型的恶性进展肿瘤提供了新的治疗策略。
#2
研究思路
Methods
研究人员通过对CRC患者来源的类器官模型进行研究，发现线粒体自噬缺陷的肿瘤对诱导铁死亡的治疗非常敏感，并且诱导铁死亡可选择性地抑制线粒体自噬缺陷肿瘤的体内生长和远处转移。机制上，研究人员发现癌细胞通过脂质过氧化-ATF4-Parkin通路激活线粒体自噬，限制脂质过氧化产物的生成，从而抑制铁死亡的发生。线粒体自噬是癌细胞固有的抗铁死亡机制之一，在高度恶性的线粒体自噬缺陷肿瘤中缺乏这一抗铁死亡机制，因此这些肿瘤易发生铁死亡。
#3
研究结果
Results
1. 线粒体自噬缺陷使PDO对铁死亡具有敏感性
为了识别对铁死亡诱导疗法敏感的肿瘤，研究人员建立了一个CRC类器官生物样本库，包括来自患者的17个CRC PDO。研究人员使用铁死亡诱导剂咪唑酮erastin（IKE）处理PDO，发现P4、P7、P15、P16 PDO对IKE敏感，P3、P13、P14、P17 PDO对IKE有明显抵抗。通过RNA测序对PDO进行了转录组分析，并比较了铁死亡易感组（P4、P7、P15和P16）和铁死亡抵抗组（P3、P13、P14和P17）之间的mRNA谱。GO分析显示，在铁死亡易感组中，线粒体自噬通路显著下调；GSEA基因富集分析发现线粒体自噬通路在铁死亡易感组中被高度下调；在所有对铁死亡敏感的PDO中，线粒体自噬通路的重要分子Parkin和PINK1的表达均显著降低。进一步分析发现Parkin或PINK1的表达与癌细胞对铁死亡诱剂的敏感性呈负相关，表明线粒体自噬缺陷的癌细胞对铁死亡敏感。研究人员在结直肠癌细胞株HCT116和乳腺癌细胞株MDA-MB-231中敲除线粒体自噬基因Parkin，发现线粒体自噬缺陷的结直肠癌细胞和乳腺癌细胞对IKE或胱氨酸剥夺或RSL3诱导的铁死亡更敏感，表现为脂质过氧化和铁死亡显著增加（图1）。
图1 线粒体自噬缺陷的结直肠癌患者来源的类器官对铁死亡诱导剂敏感
研究人员还发现，敲除另一个线粒体自噬基因PINK1也可以显著增强癌细胞对铁死亡诱剂erastin或胱氨酸剥夺或RSL3的敏感性。此外，在结直肠癌细胞和乳腺癌细胞中，使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1抑制线粒体自噬显著增强了erastin或胱氨酸剥夺或RSL3诱导的铁死亡（图2）。表明线粒体自噬缺陷确实促进了癌细胞中的铁死亡。这些结果表明，线粒体自噬缺陷的癌症易发生铁死亡。此外，在人类癌细胞和人类肿瘤中，线粒体自噬是铁死亡敏感性的重要调节因子。
图2 线粒体自噬缺陷的癌细胞对铁死亡诱导剂敏感
2. ATF4介导的Parkin表达促进癌细胞铁死亡过程中的线粒体自噬
为了探索线粒体自噬调节癌症对铁死亡敏感性的机制，研究人员首先分析了癌细胞铁死亡过程中线粒体自噬的变化。用erastin、RSL3或IR处理癌细胞诱导铁死亡，同时分析铁死亡诱导过程中的线粒体自噬。发现在HCT116和MDA-MB-231癌细胞中，erastin或RSL3或IR处理以时间和浓度依赖性的方式增加线粒体自噬，提示增强的线粒体自噬参与了癌细胞铁死亡过程中细胞命运的调控。
分析铁死亡过程中线粒体自噬相关基因表达发现，在HCT116和MDAMB-231癌细胞中，erastin增加了Parkin的mRNA和蛋白水平，而不影响线粒体自噬的其他调节因子，表明在铁死亡诱导过程中Parkin转录的增加可能是癌细胞线粒体自噬增强的原因。在癌细胞中分别敲除铁死亡相关的转录因子，并分析Parkin mRNA水平。敲除ATF4后，在生理和erastin或RSL3或胱氨酸剥夺处理条件下，癌细胞中Parkin的mRNA和蛋白水平显著降低，而ATF4过表达足以在mRNA和蛋白水平激活内源性Parkin表达。
为了确定ATF4是否直接调控Parkin基因的转录，研究人员分析了Parkin启动子-荧光素酶报告基因构建的转录活性对ATF4活性的依赖性。发现在erastin或RSL3或胱氨酸剥夺处理条件下，Parkin启动子对ATF4的缺失或存在完全应答。研究人员在Parkin启动子上发现了一个潜在的CREB/ATF位点，该位点在多种物种中高度保守。ChIP-qPCR检测表明，内源性ATF4容易与Parkin基因启动子中包含CREB/ATF基序的DNA区域结合（图3）。这些结果表明，在癌细胞铁死亡过程中，增强的线粒体自噬清除了受损的线粒体，减少了线粒体ROS的产生，从而限制了脂质过氧化的产生，最终削弱了铁死亡的发生。在线粒体自噬缺陷的癌细胞中，线粒体产生的大量ROS导致对脂质过氧化生成的限制被释放，这使得癌细胞对铁死亡诱导剂非常敏感。
图3 癌细胞铁死亡过程中线粒体自噬增强
3. 脂质过氧化-ATF4-Parkin-线粒体自噬负反馈通路限制了脂质过氧化产物的生成，从而阻止癌症中的铁死亡
进一步探索了铁死亡过程中ATF4活化的分子机制。结果表明，铁死亡诱导剂增强了ATF4的蛋白水平，因此推测癌细胞在铁死亡诱导过程中可能遭受了内质网应激。erastin明显激活了内质网应激，表现为癌细胞中PERK/eIF2𝛼/ATF4信号通路的激活。脂质过氧化物清除剂ferrostatin-1（Fer-1）强烈抑制了内质网应激，并在铁死亡诱导过程中降低了ATF4和Parkin的表达，提示癌细胞中可能存在脂质过氧化-ATF4-parkin-线粒体自噬负反馈通路，通过限制脂质过氧化产物的生成来抵抗铁死亡。
为了证实这一负反馈通路的存在，分析了在铁死亡过程中连续多个时间点抑制或激活这一通路对癌细胞线粒体ROS、脂质过氧化和铁死亡的影响。结果发现，在ATF4敲除的癌细胞中，线粒体ROS在铁死亡诱导的早期阶段显著累积，并在erastin处理后逐渐增加；脂质过氧化和细胞死亡在铁死亡诱导的早期阶段就明显增加，并且随着erastin处理时间的延长逐渐加重。相比之下，在ATF4过表达的癌细胞中，线粒体ROS在整个铁死亡诱导过程中保持稳定，即使在铁死亡诱导的后期也没有显著增加，脂质过氧化和细胞死亡并没有增加。在癌细胞中敲除或过表达Parkin，得到了相似的结论（图4）。这些结果表明，脂质过氧化-ATF4-线粒体自噬负反馈通路减少了线粒体ROS的积累，进而限制了癌细胞中脂质过氧化的急剧增加，并将脂质过氧化维持在低水平，从而抑制铁死亡的启动。
图4 脂质过氧化-ATF4-Parkin-线粒体自噬负反馈通路限制脂质过氧化，从而阻止癌症中的铁死亡
4. 线粒体自噬缺陷肿瘤易发生铁死亡
研究人员推测高度恶性线粒体自噬缺陷肿瘤缺乏脂质过氧化-ATF4-parkin-线粒体自噬负反馈通路介导的抗铁死亡机制，这可能增加了这些肿瘤对铁死亡的易感性。裸鼠皮下接种野生型HCT116或MDA-MB-231癌细胞（Parkin-WT）和线粒体自噬缺陷型HCT116或MDA-MB231癌细胞（parkin-KO）。随后用铁死亡诱导性药物erastin（IKE）、Lipro-1或这两种药物同时处理。发现在携带Parkin-敲除异种移植瘤的小鼠中，IKE治疗显著抑制了肿瘤的生长，并增强了肿瘤的脂质过氧化，而Lipro-1治疗明显抑制了IKE的作用，提示线粒体自噬缺陷的肿瘤对体内诱导铁死亡的治疗敏感。
研究人员构建体内外肿瘤放疗模型，发现放疗减少了Parkin敲除乳腺癌细胞和结直肠癌细胞的细胞克隆数量，增加了脂质过氧化。此外，研究人员发现MDA-MB-231-Parkin敲除异种移植瘤对放疗敏感，表现为脂质过氧化作用显著升高和肿瘤生长停滞；Lipro-1治疗显著逆转了放疗介导的脂质过氧化增加，并降低了肿瘤生长。研究人员使用抗PD1抗体、Lipro-1或这两种药物治疗小鼠。发现在携带B16-Parkin敲除肿瘤的免疫正常C57小鼠中，系统性PD1抗体靶向治疗显著升高了脂质过氧化，并抑制了肿瘤生长。Lipro-1显著抑制了抗PD1介导的对Parkin敲除肿瘤的抗肿瘤作用（图5）。这些结果表明，线粒体自噬缺陷的肿瘤易受IKE、放疗和免疫治疗诱导的铁死亡的影响。
图5 线粒体自噬缺陷的肿瘤生长易发生铁死亡
进一步探讨了线粒体自噬缺陷的肿瘤转移是否易受铁死亡的影响。左心室和尾静脉注射稳定表达荧光素酶报告基因的癌细胞，分别建立结直肠癌和乳腺癌骨转移和肺转移模型。用溶剂对照或IKE处理小鼠。在注射线粒体自噬缺陷癌细胞的小鼠中，骨转移和肺转移显著较大。在注射线粒体自噬缺陷肿瘤细胞的小鼠中，通过IKE诱导铁死亡强烈抑制了骨转移和肺转移，并且Lipro-1在线粒体自噬缺陷肿瘤中显著抑制了IKE介导的抗转移作用。
研究人员探究IKE治疗是否影响注射线粒体自噬缺陷肿瘤细胞的小鼠的生存，发现IKE治疗显著提高了肺转移模型小鼠和骨转移模型小鼠的中位总生存期，Lipro-1治疗显著缩短了携带线粒体自噬缺陷肿瘤的IKE治疗小鼠的生存期，进一步证实铁死亡在线粒体自噬缺陷癌症中具有强效抗转移活性。研究人员使用脾内注射野生型或线粒体自噬缺陷的癌细胞诱导乳腺癌和结直肠癌的肝转移。结果显示，注射线粒体自噬缺陷癌细胞的小鼠的肝转移显著增加；IKE可明显抑制线粒体自噬缺陷型肿瘤细胞的肝转移；IKE治疗显著降低了肝内肿瘤结节数量、肝重量和肝重量/体重比；Lipro-1显著抑制IKE的抗转移作用（图6）。
图6 线粒体自噬缺陷的肿瘤转移易发生铁死亡
小结
该研究发现，以线粒体自噬缺陷为特征的患者来源的肿瘤对诱导铁死亡的治疗非常敏感。机制研究发现，脂质过氧化的负反馈调节通路是肿瘤细胞重要的内在抗铁死亡机制之一。更重要的是，铁死亡诱导疗法可在体内选择性抑制线粒体自噬缺陷肿瘤的生长和远处转移。该研究表明，线粒体自噬缺陷的肿瘤易被诱导铁死亡，这可能为开发线粒体自噬缺陷肿瘤的新治疗策略提供线索。
参考文献
Liu S, Chen JH, Li LC, Ye ZP, Liu JN, Chen YH, Hu BX, Tang JH, Feng GK, Li ZM et al: Susceptibility of Mitophagy-Deficient Tumors to Ferroptosis Induction by Relieving the Suppression of Lipid Peroxidation. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 2024:e2412593. DOI: 10.1002/advs.202412593.
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