摘要：caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎症性caspase家族的重要成员，在人类固有免疫应答中发挥核心作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）激活非经典炎症通路，进而切割Gasdermin D（GSDMD）并介导细胞焦亡（pyroptosis）和炎症因

caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎症性caspase家族的重要成员，在人类固有免疫应答中发挥核心作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）激活非经典炎症通路，进而切割Gasdermin D（GSDMD）并介导细胞焦亡（pyroptosis）和炎症因子释放。尽管底物鉴定对解析Caspase-4的生物学功能与调控网络至关重要，但由于酶-底物相互作用瞬时性及切割效率低下等挑战，传统基于酶切产物富集的方法难以系统揭示其底物谱系。

2025年3月12日，清华大学尹航（点击查看介绍）课题组在Angew. Chem. Int. Ed.发表研究，创新性地将基因密码子扩展与光交联蛋白质组学结合，开发了一种高效捕获Caspase底物的新方法。该技术突破了传统酶活性依赖策略的局限性，为焦亡及相关信号通路研究提供了强有力的工具。

作者基于Caspase-4与底物GSDMD的互作界面，利用基因密码子扩展技术，将光敏非天然氨基酸pBpa精准嵌入Caspase-4的底物结合区域（K356位点），构建了光交联探针CASP4(C258A)-3C-pBpa。并巧妙引入三重功能模块：1）通过C258A催化位点突变消除蛋白酶活性，避免底物降解导致的信号丢失；2）插入HRV-3C蛋白酶切割位点维持天然构象与底物结合能力；3）利用pBpa的光交联特性共价锁定瞬时相互作用。该探针成功克服传统方法的技术瓶颈，实现了对弱结合底物的高效捕获。

图1. 光交联探针设计与验证。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

作者首先采用高分辨质谱等技术对构建的光交联探针进行分子表征，确认探针的分子量及结构完整性。通过底物切割实验与蛋白质互作分析，证实探针的结构修饰（包括催化位点失活突变与蛋白酶切位点插入）未影响Caspase-4的天然构象与功能特性。体外交联实验显示，该探针能够在紫外激活下高效捕获已知底物GSDMD，并系统性富集裂解液中的相互作用蛋白，展现出显著优于传统方法的底物捕获能力。

结合定量蛋白质组学（Label-Free Quantification, LFQ），作者从THP-1细胞裂解液中鉴定出156种潜在底物。为验证技术可靠性，作者选取部分候选蛋白进行体外切割实验，证实了包括AKT1、CASP5/12在内的16种蛋白可被Caspase-4切割。这些实验结果不仅验证了光交联探针技术的高效性与准确性，更通过新底物的发现为解析焦亡通路中酶-底物结合特异性、信号交叉调控等关键科学问题提供了重要线索。

图2. 组学分析与底物验证。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

在众多新发现的底物中，尤其值得关注的是，研究首次揭示Caspase-4可通过特异性切割AKT1的D108位点，移除其PH自抑制结构域，释放激酶活性核心。这一发现提示细胞焦亡通路可能通过AKT1调控网络与细胞存活、代谢等进程产生交叉对话。此外，Caspase-4对同家族蛋白酶Caspase-5/12前体的激活作用，揭示了炎症性caspase间存在级联放大机制，为先天免疫应答调控提供了新视角。

小结

本研究通过技术创新与方法学突破，成功构建了具有光亲和能力的Caspase-4光交联探针系统，解决了caspase底物鉴定的关键难题。研究不仅系统扩展了Caspase-4的底物谱系，更揭示了其通过切割AKT1等关键调控蛋白实现焦亡通路与细胞稳态网络的跨维度对话，以及通过激活同源蛋白酶形成级联放大效应的新机制。这些发现为深入解析细胞焦亡的分子调控网络、阐明感染性疾病与炎症相关疾病的发病机理提供了重要理论依据，同时发展的技术平台为其他瞬时弱相互作用酶-底物系统的研究提供了普适性解决方案。

论文第一作者是清华大学化学系博士生周易，通讯作者是清华大学药学院尹航教授。该项研究得到了国家自然科学基金、国家卫健委基金、北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心等项目资助。

A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics Approach Provides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4 Substrates

Yi Zhou, Xinyu Zhang, and Hang Yin*

Angew. Chem. Int. Ed., 2025, DOI: 10.1002/anie.202501535

导师介绍

尹航

来源：X一MOL资讯