摘要:caspase-4(半胱天冬酶-4)是炎症性caspase家族的重要成员,在人类固有免疫应答中发挥核心作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)激活非经典炎症通路,进而切割Gasdermin D(GSDMD)并介导细胞焦亡(pyroptosis)和炎症因
caspase-4(半胱天冬酶-4)是炎症性caspase家族的重要成员,在人类固有免疫应答中发挥核心作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)激活非经典炎症通路,进而切割Gasdermin D(GSDMD)并介导细胞焦亡(pyroptosis)和炎症因子释放。尽管底物鉴定对解析Caspase-4的生物学功能与调控网络至关重要,但由于酶-底物相互作用瞬时性及切割效率低下等挑战,传统基于酶切产物富集的方法难以系统揭示其底物谱系。
2025年3月12日,清华大学尹航(点击查看介绍)课题组在Angew. Chem. Int. Ed.发表研究,创新性地将基因密码子扩展与光交联蛋白质组学结合,开发了一种高效捕获Caspase底物的新方法。该技术突破了传统酶活性依赖策略的局限性,为焦亡及相关信号通路研究提供了强有力的工具。
作者基于Caspase-4与底物GSDMD的互作界面,利用基因密码子扩展技术,将光敏非天然氨基酸pBpa精准嵌入Caspase-4的底物结合区域(K356位点),构建了光交联探针CASP4(C258A)-3C-pBpa。并巧妙引入三重功能模块:1)通过C258A催化位点突变消除蛋白酶活性,避免底物降解导致的信号丢失;2)插入HRV-3C蛋白酶切割位点维持天然构象与底物结合能力;3)利用pBpa的光交联特性共价锁定瞬时相互作用。该探针成功克服传统方法的技术瓶颈,实现了对弱结合底物的高效捕获。
图1. 光交联探针设计与验证。图片来源:Angew. Chem. Int. Ed.
作者首先采用高分辨质谱等技术对构建的光交联探针进行分子表征,确认探针的分子量及结构完整性。通过底物切割实验与蛋白质互作分析,证实探针的结构修饰(包括催化位点失活突变与蛋白酶切位点插入)未影响Caspase-4的天然构象与功能特性。体外交联实验显示,该探针能够在紫外激活下高效捕获已知底物GSDMD,并系统性富集裂解液中的相互作用蛋白,展现出显著优于传统方法的底物捕获能力。
结合定量蛋白质组学(Label-Free Quantification, LFQ),作者从THP-1细胞裂解液中鉴定出156种潜在底物。为验证技术可靠性,作者选取部分候选蛋白进行体外切割实验,证实了包括AKT1、CASP5/12在内的16种蛋白可被Caspase-4切割。这些实验结果不仅验证了光交联探针技术的高效性与准确性,更通过新底物的发现为解析焦亡通路中酶-底物结合特异性、信号交叉调控等关键科学问题提供了重要线索。
图2. 组学分析与底物验证。图片来源:Angew. Chem. Int. Ed.
在众多新发现的底物中,尤其值得关注的是,研究首次揭示Caspase-4可通过特异性切割AKT1的D108位点,移除其PH自抑制结构域,释放激酶活性核心。这一发现提示细胞焦亡通路可能通过AKT1调控网络与细胞存活、代谢等进程产生交叉对话。此外,Caspase-4对同家族蛋白酶Caspase-5/12前体的激活作用,揭示了炎症性caspase间存在级联放大机制,为先天免疫应答调控提供了新视角。
小结
本研究通过技术创新与方法学突破,成功构建了具有光亲和能力的Caspase-4光交联探针系统,解决了caspase底物鉴定的关键难题。研究不仅系统扩展了Caspase-4的底物谱系,更揭示了其通过切割AKT1等关键调控蛋白实现焦亡通路与细胞稳态网络的跨维度对话,以及通过激活同源蛋白酶形成级联放大效应的新机制。这些发现为深入解析细胞焦亡的分子调控网络、阐明感染性疾病与炎症相关疾病的发病机理提供了重要理论依据,同时发展的技术平台为其他瞬时弱相互作用酶-底物系统的研究提供了普适性解决方案。
论文第一作者是清华大学化学系博士生周易,通讯作者是清华大学药学院尹航教授。该项研究得到了国家自然科学基金、国家卫健委基金、北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心等项目资助。
A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics Approach Provides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4 Substrates
Yi Zhou, Xinyu Zhang, and Hang Yin*
Angew. Chem. Int. Ed., 2025, DOI: 10.1002/anie.202501535
导师介绍
尹航
来源:X一MOL资讯