产量达93g/L，天津工业生物所等改造谷氨酸棒杆菌，高效合成L-高丝氨酸

摘要：L-高丝氨酸是一种非蛋白质氨基酸，虽然它不参与蛋白质的合成，但在食品、饲料、化妆品及制药行业中有着广泛的应用。它不仅是合成多种化合物的关键前体，还因其与草铵膦（一种广泛使用的除草剂）的化学结构相似，为绿色生物制造活性L-草铵膦提供了新的可能。

L-高丝氨酸是一种非蛋白质氨基酸，虽然它不参与蛋白质的合成，但在食品、饲料、化妆品及制药行业中有着广泛的应用。它不仅是合成多种化合物的关键前体，还因其与草铵膦（一种广泛使用的除草剂）的化学结构相似，为绿色生物制造活性L-草铵膦提供了新的可能。

传统上，L-高丝氨酸主要通过化学合成生产，但这种方法存在产量低、使用危险化学品和环境污染等问题。因此，研究人员开始探索利用微生物发酵来生产L-高丝氨酸，尤其是利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）这一“细胞工厂”。谷氨酸棒杆菌在氨基酸发酵领域有着悠久的历史，尤其是在生产 L-谷氨酸和L-赖氨酸方面表现出色。然而，野生型的谷氨酸棒杆菌并不能高效积累L-高丝氨酸。

为了突破这一限制，近日，中国科学院天津工业生物技术研究所的徐宁团队和东北农业大学生命科学学院的姜巨全团队合作，在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 上发表了一项题为“Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for Efficient LHomoserine Production from Lignocellulose-Derived Sugars”的研究，通过代谢工程改造谷氨酸棒杆菌，高效利用木质纤维素衍生糖生产L-高丝氨酸。

L-高丝氨酸的合成途径始于 L-天冬氨酸，经过三步反应生成，涉及三个关键基因：lysC、asd 和 hom。研究人员首先通过基因编辑技术精准敲除了 thrB 基因，阻断了 L-高丝氨酸的降解途径，构建了基础生产菌株 THC1。接着，他们对 lysC 和 hom 基因进行了定点突变（lysC 的 T311I 突变和 hom 的 G378E 突变），并过表达这些基因，有效缓解了反馈抑制，使得更多的碳代谢流向 L-高丝氨酸的合成。

为了进一步提升产量，研究人员还敲除了 alaT 和 ddh 基因，减少了 L-丙氨酸和 L-赖氨酸等副产物的生成。此外，他们还引入了来自大肠杆菌的 rhtB 基因，强化了 L-高丝氨酸的外排能力，减少了胞内产物积累对合成途径的抑制。通过这些基因工程手段，研究人员成功构建了一个高效生产 L-高丝氨酸的菌株。

图 | L-高丝氨酸的生物合成途径及菌株改造效果

不过，研究人员发现，在谷氨酸棒杆菌株合成 L-高丝氨酸的过程中，原料葡萄糖主要通过磷酸烯醇式丙酮酸：糖磷酸转移酶系统（PTS）被摄取。PTS 系统虽然高效，但它会消耗大量的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），影响碳代谢流的分配，进而限制菌株对于，L-高丝氨酸的合成。

为了解决这一问题，研究人员探索了非 PTS 依赖的葡萄糖摄取系统。通过过表达肌醇渗透酶（如 iolT1）和葡糖激酶（如来自枯草芽孢杆菌的 Bsglk 基因与 ppgK 基因），菌株利用非 PTS 途径摄取葡萄糖并进行磷酸化的能力得到了明显增强。同时，他们还对 iolT1 基因的启动子进行了改造，解除了 IolR 蛋白对其表达的抑制，最终显著提高了菌株在葡萄糖为碳源时的生长性能和 L-高丝氨酸产量。

图 | 谷氨酸棒杆菌中葡萄糖的摄取和利用途径

研究人员还引入了异源的 NADP 依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（如来自酿脓链球菌的 SpgapN）或 Entner-Doudoroff（ED）途径（如来自希瓦氏菌的 SoED 途径）。这些改造有效增加了胞内 NADPH 的供应，为 L-高丝氨酸的合成提供了充足的还原力，进一步提升了产量。

除了葡萄糖，木糖和纤维二糖也是木质纤维素水解产物中的重要成分。然而，野生型谷氨酸棒杆菌无法利用木糖。为了拓展其碳源利用范围，研究人员将来自大肠杆菌的 xylA 基因（编码木糖异构酶）和谷氨酸棒杆菌自身的 xylB 基因（编码木酮糖激酶）导入菌株，并通过核糖体结合位点（RBS）工程对这两个基因的表达进行精细调控。经过筛选，研究人员获得了能够高效利用木糖的菌株，其中携带优化表达 xylA 和 xylB 基因的 P#70 质粒的菌株表现最为突出。不仅如此，研究人员还通过分泌和表面展示策略，成功实现了对纤维二糖的有效利用。他们将来自嗜热裂孢菌的 β-葡萄糖苷酶（BGL）与谷氨酸棒杆菌的 porin 蛋白和信号肽融合，在不同强启动子的驱动下，增强 BGL 的分泌和表面定位。实验结果表明，融合 CgR0949 信号序列和 Tfu_0937 的菌株在纤维二糖为碳源时生长良好，且能够积累一定量的 L-高丝氨酸。