摘要：在药物开发、材料科学和分子生物学等多个领域中，肽类分子因其高度特异性和生物活性被广泛关注。然而，在这些具有巨大应用潜力的分子中，包含N-甲基化或α,α-二取代氨基酸的“难肽”因其位阻大、反应慢，长期以来难以通过传统固相肽合成（SPPS）方法高效合成。这一技术瓶
开发“类核糖体反应器”，攻克高位阻肽合成难题
在药物开发、材料科学和分子生物学等多个领域中，肽类分子因其高度特异性和生物活性被广泛关注。然而，在这些具有巨大应用潜力的分子中，包含N-甲基化或α,α-二取代氨基酸的“难肽”因其位阻大、反应慢，长期以来难以通过传统固相肽合成（SPPS）方法高效合成。这一技术瓶颈，严重制约了高难度肽药物的研发效率。
在此，南京大学姚祝军教授、刘发博士提出一种全新“固相分子反应器”合成策略，开发出一种类核糖体机制的“分子反应器”（ribosome-mimicking molecular reactor, RMMR），显著提高了空间位阻大、难偶联氨基酸的固相合成效率，实现了对多类难肽的高质量自动化合成，相关成果以“Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides”为题，发表在《Nature Chemistry》上，第一作者为魏思媛。
类核糖体反应器，让“难肽”也能高效自动合成！
作者受核糖体催化机制启发，创新性地将多功能活性位点锚定在传统的固相树脂上，使反应不再依赖液-固两相间的扩散，而是转变为“树脂内近距离转移”的拟均相过程。该策略有效解决了传统SPPS在处理N-甲基化或α,α-二取代等“难偶联”氨基酸时反应慢、产率低的难题。该方法无需特殊设备，兼容现有商业化自动化合成平台和通用试剂，极具推广潜力。
研究以商业氨甲基聚苯乙烯（AM）树脂为载体，设计出含有多个活性位点和一个肽合成锚点的“分子反应器”。通过控制反应中的“开启”和“关闭”状态，实现了类似核糖体中肽酰转移酶的近距离反应模式（图1c）。其中关键在于利用二异丙基碳二亚胺（DIC）活化氨基酸，在树脂上原位生成多个活性酯，从而在反应器内部或反应器间直接完成酰基转移（图2路径Ⅰ/Ⅱ），极大提高了偶联效率。
图1：与传统SPPS相比，基于RMMR的方法
图2：基于RMMR的协议中可能的酰基转移途径
RMMR构建完成后，作者首先验证了其合成常规肽的能力。实验显示，无论是人工四肽（QWRK-NH₂）还是天然八肽（血管紧张素II），使用RMMR树脂合成的粗品纯度与传统Rink树脂相当，甚至略优（图3c-d）。更重要的是，该方法在30肽长序列的合成中仍保持高纯度（>97%），可实现从手动到自动化无缝切换（图3e），展现出极高的可扩展性。
图3：RMMR的组装和对肽合成的能力验证
通过对RMMR中激活位点数量进行系统优化，作者发现四位点设计在空间适配与反应效率之间达到了最佳平衡。进一步的对比实验表明，传统SPPS即便采用HATU、DIC/Oxyma等活化剂，也无法合成高纯度的N-甲基肽段，而RMMR体系在仅用DIC的条件下即可实现>90%的偶联效率。此外，通过控制反应器密度，研究团队证实“反应器内/反应器间”双通道机制确实存在且有效协同。团队选取了13种包含1~2个N-甲基氨基酸的中短肽作为测试对象，其中包括合成难度极高的NMeVal残基。实验发现，在使用Oxyma-C修饰的RMMR树脂下，所有目标肽的粗品纯度均超过60%，其中一半以上超过90%（图4b）。相比之下，传统Rink树脂仅能得到10%左右甚至完全无产物。特别是对于包含连续两个N-甲基位点的肽段（如NMeVal-NMeVal），通过双偶联或微波加热也可实现60%的高纯度产物。
图4：含有N-甲基化氨基酸的空间阻碍肽的合成
在验证了对线性“难肽”的高效合成能力后，研究团队将目光投向了被认为“难中之难”的高密度N-甲基环肽。以免疫抑制药物环孢素A为蓝本，作者成功合成了其NMeLeu改造版本，仅用74小时即可完成11肽序列组装和闭环反应（图5），粗品纯度88%，分离产率70%，远超传统方法
图5：成功合成密集N-甲基环肽
RMMR策略的通用性进一步体现在α,α-二取代氨基酸的合成中。研究团队选取Aib、Ac5c、αMePhe、αMeLeu等共14种不同结构、不同位置的代表性序列进行测试，全部获得90%以上甚至接近定量的粗品纯度（图6a）。即便是包含6个连续Aib的长肽，也能实现95%纯度的自动合成。这一成绩在传统SPPS体系下几乎难以企及。为进一步验证RMMR策略的极限能力，研究团队合成了一种含8个Aib残基的肽类抗生素Alamethicin F类似物。这一类肽因其高Aib含量和非天然结构被视为SPPS挑战极限。在RMMR支持下，通过标准自动化合成流程，成功获得88%纯度的目标肽，分离产率达73%，远优于现有所有公开文献报道。
图6：含有α，α-脱取代氨基酸的空间阻碍肽的合成。
总结与展望
本研究提出的RMMR策略，以其独特的结构设计与近场酰基转移机制，彻底颠覆了传统SPPS中“高位阻=难偶联”的认知。其对N-甲基和α,α-二取代氨基酸的高效、自动化、温和合成，标志着固相肽合成进入“精准高通量”的新时代。未来，RMMR有望在多肽药物、仿生材料、分子机器等领域发挥重要作用，加速高难度肽类的工业化落地与临床转化。
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来源：永远不想睡觉
