摘要：在自然界中，核糖体被誉为“蛋白质工厂”，能够高效、精准地将 20 种标准氨基酸组装成长链线性多肽。然而，这种“线性组装”所形成的蛋白质结构在热稳定性、酶解抵抗性以及与靶点的结合效率等方面仍存在天然局限。
在自然界中，核糖体被誉为“蛋白质工厂”，能够高效、精准地将 20 种标准氨基酸组装成长链线性多肽。然而，这种“线性组装”所形成的蛋白质结构在热稳定性、酶解抵抗性以及与靶点的结合效率等方面仍存在天然局限。
相比之下，具有主链闭环结构的肽类分子（如青霉素、Patellamide C 等抗菌肽）则展现出更优的构象稳定性、生物活性和药用潜力，但这类结构在自然界中通常依赖酶促修饰才能形成，缺乏可控性，也难以实现规模化合成。
近日，韩国浦项科技大学 Joongoo Lee 团队在 Nature Communications 上发表一篇题为“Expanded ribosomal synthesis of nonstandard cyclic backbones in vitro”的成果。该团队在体外，利用设计合成的非天然氨基酸，实现核糖体催化的非标准主链闭环结构合成，即令核糖体在 37 ℃、pH 7.5 等生理条件下直接合成含有 5 元和 6 元环状主链结构的多肽。这项工作不仅拓展了核糖体的催化反应类型，更为抗菌肽、药物先导分子及功能型生物高分子设计提供了新思路。
为了实现这一突破，研究团队设计了 26 种“非标准单体”（non-canonical monomers, ncMs），包括二羧酸酯类和肼基酯类，这些分子既具亲核官能团又具亲电中心，可在核糖体的肽酰转移酶中心（PTC）内发生序贯的氨解反应，实现主链内部的闭环。
图 | 非天然单体设计及其在核糖体中形成环状主链结构
随后，他们利用灵活酶（Flexizyme）将这些 ncMs 高效地连接到特定 tRNA 上，并通过无细胞翻译系统将其连续翻译到 mRNA 模板编码的肽链中。令人惊喜的是，在多个组合下，系统可稳定形成 5 元或 6 元的环状骨架结构，生成了此前从未通过核糖体合成过的结构单元。
研究还进一步通过系统性调控 ncMs 的结构参数，探索了影响环化效率的关键因素：
碳链长度：三碳骨架（如丙二酸酯）衍生的 ncMs 更容易形成五元环，且环化效率接近 100%；而四碳骨架（丁二酸酯）形成六元环的效率明显下降；离去基团性质：引入更优的离去基团，如苯氧基，可显著提升 6 元环的形成速率；取代基体积和电子效应：取代基过大（如叔丁基）会造成空间位阻，抑制亲核进攻，而体积适中、电子性质适宜的取代基（如甲氧基）则可降低活化能、提高反应效率
这些结果表明，环化反应不仅由分子设计驱动，还高度依赖反应中心在核糖体内部的空间几何构型匹配性。
图 | 核糖体能高效合成 5 元环（吡唑烷二酮）,但6元环（四氢哒嗪二酮）的产率较低
为了确认环化反应确实由核糖体催化，研究团队进行了严谨的对照实验。他们发现，在无核糖体条件下，环化产物比例不会随时间增加，排除了自发反应的可能性。更令人惊讶的是，仅使用模拟核糖体活性中心的 RNA 片段（P1c2UGGU）也能催化环化反应，而缺乏关键序列的 RNA 则完全无效。这些实验证明，环化反应依赖于核糖体 RNA 核心的催化活性，而不仅仅是简单的分子靠近效应。
此外，研究人员还通过化学交联实验揭示了反应机制：肼酯的 α-氮原子首先形成肽键，随后 β-氮原子完成环化，这一过程完美契合了核糖体对 α-氨基酸的天然偏好。
值得注意的是，研究团队还进一步验证了该平台的拓展能力，即通过在 mRNA 上设计多个非天然密码子位点，实现了非标准单体（ncMs）在特定位置的重复插入和精确控制。在双环化单元的设计实验中，系统成功合成了具有双主链闭环结构的多肽分子，质谱分析证实，这些产物完全按照预期完成了闭环反应，展现出极高的合成精确度。这表明，该合成系统不仅具有出色的模块化设计能力，更能在序列水平上实现多位点、多类型的闭环精确控制，有望未来应用于合成结构更复杂的抗菌肽、抑制剂或分子探针。
长期以来，核糖体被视为一种保守、特异性强的合成机器，仅适用于线性肽链构建。然而本研究首次证明，核糖体在适当分子设计辅助下，可直接构建自然界之外的非标准主链环状骨架并建立了一个可调、模块化的反应平台，有望广泛应用于药物先导分子的开发等，为构建新一代多功能合成生物分子开辟了新道路。
参考文献：
1. Lee, K., Park, H., Devarapalli, R.K. et al. Expanded ribosomal synthesis of non-standard cyclic backbones in vitro. Nat Commun 16, 4957 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60126-4
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来源：生辉SciPhi