Neuron：利用CRISPRi筛选技术揭示神经元与胶质细胞之间作用机制

摘要：2025年1月14日，加州大学旧金山分校Martin Kampmann在Neuron杂志发表研究论文“CRISPRi-based screens in iAssembloids to elucidate neuron-glia interactions”，提出

2025年1月14日，加州大学旧金山分校Martin Kampmann在Neuron杂志发表研究论文“CRISPRi-based screens in iAssembloids to elucidate neuron-glia interactions”，提出在iAssembloids中进行基于CRISPR干扰的筛选以阐明神经元与神经胶质细胞的相互作用。

人类大脑的复杂性使得理解其功能背后的分子机制颇具挑战。全基因组关联研究已经发现了与神经表型相关的变异。为了便于对脑细胞类型中的因果分子机制进行可扩展的探究，作者开发了一种由诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的神经元和神经胶质细胞的三维共培养系统，称之为类组装体（iAssembloids）。利用类组装体，探究神经胶质细胞和神经元细胞如何相互作用以控制神经元的死亡与存活。基于CRISPR干扰（CRISPRi）的筛选确定，糖原合成酶激酶3β（GSK3β）抑制由神经元高活动引发的、具有保护作用的核因子E2相关因子2（NRF2）介导的氧化应激反应。随后研究了阿尔茨海默病风险变异体载脂蛋白E-ε4（APOE-ε4）在神经元存活中的作用。作者发现，与表达APOE-ε3的星形胶质细胞相比，表达APOE-ε4的星形胶质细胞可能会促进神经元的过度活跃。这个平台能够对神经元-神经胶质细胞相互作用的机制进行无偏向性识别。该研究为深入理解神经元-胶质细胞交互作用提供了新的视角，并为开发针对神经保护的新疗法提供了潜在靶点。

1. 将hiPSC衍生的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞整合到iAssembloids中

为了构建一个可用于基于CRISPRi基因筛选方法的、可扩展的三维神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞共培养系统，作者挑选了针对hiPSC衍生的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的分化方案。在构建iAssembloids时，将分化后的星形胶质细胞与未成熟的分化神经元（第0天）以3个神经元比1个星形胶质细胞的比例接种到AggreWell 800培养板中。1周后，以星形胶质细胞数量三分之一的量加入小胶质细胞。这些培养物在孔内自组装成球体，大小均匀并且随着时间推移保持形状不变。在培养14天后，对类组装体中的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行成像。星形胶质细胞呈现出星状形态，神经元长出的突起贯穿类组装体。培养物中的神经元表达神经元细胞标志物NeuN和TUJ1。用IBA1染色的小胶质细胞分为两类：一些几乎没有突起，并向类组装体中部迁移；另一些则发出突起贯穿类组装体。星形胶质细胞S100β染色呈阳性。数据表明，这三种细胞类型整合进iAssembloids后，发育出了复杂的神经元和胶质细胞形态。

2. 在iAssembloids中培养的神经元，其功能成熟度高于单种培养的神经元

作者进行了单核RNA测序以进一步表征iAssembloids中的每种细胞类型，所鉴定出的细胞簇是基于细胞类型特异性标志物的表达。发现神经元主要表达兴奋性神经元的标志物（SLC17A7和SLC17A6），而不表达抑制性神经元的标志物。通过计算映射，发现iAssembloids中的神经元与人类胎儿大脑组织中孕周较晚（17-18周）的兴奋性神经元最为接近，而2D单培养的神经元则更接近于早期孕周。iAssembloids中的神经元相比单培养神经元，轴突导向和突触传递相关基因（包括谷氨酸受体亚基）的表达显著增加，iAssembloids中的神经元也表现出更高的谷氨酸受体亚基表达。通过多电极阵列分析评估两种培养条件下的神经元电生理活动，培养两周后iAssembloids中的神经元平均放电次数是单培养神经元的10倍。3D培养的神经元放电次数最高，而随着星形胶质细胞数量的增加，放电次数减少，表明星形胶质细胞在缓冲神经元过度兴奋方面起着重要作用。

Summary

该文使用一种名为 iAssembloids的3D共培养系统，该系统由诱导多能干细胞衍生的神经元和胶质细胞组成，并结合CRISPRi筛选技术，研究了胶质细胞对神经元活动和存活的影响。通过CRISPRi筛选，研究人员鉴定了影响神经元存活的重要分子机制。GSK3β抑制了NRF2对神经活动引发的氧化应激的反应，这对理解神经元如何应对环境压力具有重要意义。APOE4型星形胶质细胞不仅促进了神经元的过度活跃，还增加了神经元的脆弱性，强调了APOE4在神经退行性疾病中的潜在作用。为神经科学领域提供了重要的工具和技术，能够更深入地探究神经元和胶质细胞之间的复杂互动，对于了解神经系统疾病的发生机制及开发新的治疗策略具有重要意义。