摘要：随着人类活动对淡水湖泊生态系统的快速改变，长期研究揭示了微生物群落的动态变化、进化转变以及生物地球化学相互作用的关键过程，然而病毒在这些过程中所起的作用仍未得到充分重视。在本研究中，我们基于美国威斯康星州门多塔湖20年的时间序列数据，跨时间、季节性和环境因素的

研究论文

● 期刊：Nature Microbiology(IF:20.5)

● DOI：10.1038/s41564-024-01876-7

●原文链接: https://doi.org/10.1038/s41564-024-01876-7

● 第一作者：Zhichao Zhou （周之超）

● 通讯作者：Karthik Anantharaman（karthik@bact.wisc.edu）

● 发表日期：2025-1-3

● 主要单位：

美国威斯康星大学麦迪逊分校细菌学系、深圳大学高等研究院、深圳大学合成生物学研究中心

翻译整理：深圳大学陈双双、李俊辉、饶雅雯

摘要Abstract

随着人类活动对淡水湖泊生态系统的快速改变，长期研究揭示了微生物群落的动态变化、进化转变以及生物地球化学相互作用的关键过程，然而病毒在这些过程中所起的作用仍未得到充分重视。在本研究中，我们基于美国威斯康星州门多塔湖20年的时间序列数据，跨时间、季节性和环境因素的维度，表征了130万个病毒基因组。来自Caudoviricetes纲的双链DNA噬菌体在该湖泊病毒群落中占主导地位。通过分析，我们鉴定了574个辅助代谢基因家族，涉及超过140,000个辅助代谢基因，其中包括光合作用相关的psbA、甲烷氧化相关的pmoC以及过氧化氢分解相关的katG等重要基因，这些基因在多年及季节性变化中始终存在且活跃。我们还观察到，病毒-宿主对（包括关键的蓝细菌、甲烷氧化菌和纳米浮游菌（Nanopelagicales））之间的正向关联和生态位分化在季节性变化中显现出来。此外，无机碳和铵态氮浓度对病毒丰度的影响，进一步强调了病毒在“自上而下”和“自下而上”相互作用中的重要角色。我们的结果表明，进化过程有助于适应性基因的积累，降低了基因组的异质性，并导致优势亚群的形成。这项研究为地球微生物组中病毒的生态学和进化提供了新的视角，改变了我们对其作用的传统认识。

引言Introduction

细菌和古菌的病毒（噬菌体）是生态系统中最为丰富的生物类群之一。噬菌体能够重塑微生物代谢、驱动营养循环并对全球生物地球化学循环产生重要影响。通过宏基因组获得的未培养病毒基因组显著丰富了公共病毒数据库，并深化了我们对自然界中病毒的认识。在目前最大的公共病毒数据库——IMG/VR v4中，淡水湖中的病毒基因组约占所有病毒基因组的15%，在各类环境中排名第一。尽管病毒基因组的存储量相较于海洋和土壤等环境较大，淡水湖中的病毒仍未得到充分的研究。随着地理景观和气候变化，淡水湖正面临全球范围内的快速变化。微生物群落在淡水生态系统中扮演着基础性角色，研究其病毒的多样性、功能、生态学及进化过程将加深我们对微生物群落“自上而下”控制作用的理解。

时间序列研究在微生物生态学中已被广泛应用，揭示了微生物群落动态、种群变化及其对自然生态系统的影响。长期的微生物与生物地球化学观察项目，如夏威夷海洋时间序列和百慕大大西洋时间序列，显著提高了我们对气候变化和环境变动对微生物群落动态、物质及能量流动影响的理解。除了能够观察和分析时间变化外，时间序列研究还对理解进化过程具有重要意义。例如，门多塔湖（美国威斯康星州）湖水中上层细菌群落的6年时间序列分析揭示了定期的年际动态及微生物群落与季节性驱动因素之间的关系，反映了气候变化的影响。通过追踪种群微多样性（microdiversity）的变化，最近一项研究也对鳟鱼沼泽湖（美国威斯康星州）的湖泊微生物群落进行了为期9年的时间序列考察，揭示了细菌物种形成的进化过程，并展示了两种不同进化模型的共存模式。然而，迄今为止，除了近期对噬菌体生态基因组学的表征外，关于病毒群落的时间序列研究仍然较为稀缺。近期的一项研究通过对美国威斯康星州门多塔湖和鳟鱼沼泽湖的时间序列宏基因组数据进行分析，对25个未培养的噬病毒体（virophage，针对巨型病毒的病毒）进行了表征，揭示了噬病毒体和巨型病毒之间的病毒-宿主关系，并发现了多年来的生态与进化模式。

病毒与地球化学之间的潜在关联，尤其是通过辅助代谢基因（AMG）的活性，已为人所知。AMG通过调节宿主的代谢活动或重编程代谢过程，在维持、驱动或缩短关键代谢步骤方面发挥着重要作用，为病毒提供了适应性优势。尽管近期已有研究关注淡水湖中甲烷氧化和光合作用相关的AMG，然而，与海洋中深入研究的光合作用、硫氧化、氨氧化及氨化等辅助代谢功能的研究相比，关于淡水生态系统中AMG的参与仍较为匮乏。此外，病毒种群及其生态功能如何受环境因素的影响，仍然是一个复杂且难以捉摸的问题。

在本研究中，我们利用了20年（2000-2019）时间序列宏基因组数据集（‘TYMEFLIES’ 宏基因组项目），对淡水病毒的多样性、生态学以及病毒与宿主之间的代谢关联进行了深入研究。

结果Results

淡水湖拥有巨大未表征的病毒多样性

在这项研究中，我们分析了共计471个宏基因组样本。我们将这些样本划分为六个季节（图1a和补充表1）。这些季节分类（冰季、春季、清水期、初夏、夏末和秋季）是基于环境数据定义的，能准确反映微生物物候的变化。我们的分析共鉴定出1,820,639个病毒scaffold，平均每个样品宏基因组包含约2,600个病毒scaffold（图1b和补充表2）。通过应用严格的分箱方法，我们得到了1,307,400个vMAG（病毒宏基因组组装的基因组或者病毒的bin）（图1c、扩展数据图1和补充表3）。在这项研究中，生成的病毒基因组数量约占IMG/VR v4数据库中条目的四分之一（该数据库包含约560万个高置信度病毒）。

正如CheckV评估的结果所示，病毒基因组的分箱显著提高了我们病毒序列集合的长度和完整性，从而大幅提升了整体病毒基因组的质量（图1c、扩展数据图1和补充表4）。此外，我们根据97%的序列相似度，将所有vMAGs划分为749,694个种水平分类单元。在我们的样本中鉴定的物种数量是IMG/VR v4数据库中所有高置信度病毒物种数量的四分之一（749,694 vs 2,917,521），这突显了淡水湖泊中病毒的巨大多样性。值得注意的是，物种稀疏曲线并未趋于平稳，这表明淡水湖中仍然存在大量未被发现的病毒多样性（扩展数据图1d）。为了更深入地探讨我们观察到的模式，我们检查了科水平（family）的病毒基因组分布，揭示了不同季节病毒群落之间的明显分离（图1d）。总体而言，这些结果不仅展示了病毒物种的丰富性，还突出了病毒群落的季节性和动态性。

图1 | 病毒scaffold和基因组的统计分析。

a, 每个季节在20年内获得的宏基因组数量。b, 471个宏基因组中的总宏基因组scaffold和病毒scaffold的统计数据。scaffold数量首先通过每个宏基因组100百万个reads进行标准化，以克服样本间测序深度不均的问题。c, 经过分箱后的病毒长度和完整性。CheckV质量与完整性范围：完整（100%）；高质量（90.0-100.0%）；中等质量（50.0-89.99%）；低质量（0.01-49.99%）；未确定。b和c中的箱形图显示了中位数（中央线）、均值（深红色点及标注值）、四分位间距（从25%到75%的百分位区间）和须状线。为了简便起见，未显示异常值。d, 非度量多维尺度图，展示了不同季节间病毒基因组的分布。病毒基因组丰度在科（family）水平上进行计算。ANOSIM，聚类相似性分析。

病毒分类学分析显示，Caudoviricetes纲的双链DNA病毒是主要类群，其次是Megaviricetes纲的核质大DNA病毒（图2a）。在Caudoviricetes纲中鉴定的大多数病毒物种未能进一步分类，突显了在淡水环境中此类病毒的多样性仍需深入研究。不到20%的病毒群落能预测到宿主（图2b）。在所有六个季节中，拟杆菌门是最丰富的宿主门，随后是蓝细菌门和Gamma变形菌门，这一发现与使用相同宏基因组数据的另外一项针对原核微生物的平行研究中已确定的优势门一致。宿主预测结果揭示了病毒宿主的多样性，进一步突显了这一领域中的广阔未知部分。

图2 | 病毒及其宿主的季节性丰度分布。

a, 病毒在科水平上的季节性丰度分布。所有季节中相对丰度

从广谱到窄谱宿主特异性的AMG分布模式

我们从病毒基因组中鉴定了143,751个辅助代谢基因（AMG），并将其归类为574个蛋白质家族（KEGG直系同源群，KOs，以下简称AMG蛋白家族）（补充表5）。这些蛋白质家族展现出多样化的功能库，涵盖了12个不同的类别，涉及C、N和S等重要生物地球化学过程（图3，扩展数据图2，补充表6和补充结果）。这一功能库的规模超过了先前研究的报道（例如，全球海洋调查群落中发现的34个集群，以及波罗的海中上层和底栖生物群落中发现的322个集群），这突显了我们恢复的vMAG的高度多样性。淡水AMG在多个关键过程中发挥重要作用，包括光合作用、甲烷氧化、CO2固定（用于能量和碳代谢）、氮代谢（用于核苷酸生物合成）以及硫代谢（用于有机硫降解和硫化物产生）。同时，病毒基因组和AMG表达结果表明，病毒也包含活跃表达的AMGs，这表明病毒在时间序列中参与宿主的代谢功能和生物地球化学过程（补充结果）。我们推测，类似于在其他生态系统中的作用，这些AMGs可能为病毒提供了巨大的适应性优势。

对于病毒辅助代谢基因，我们分别根据它们在广谱或窄谱宿主范围内的分布对其进行了分类。广谱宿主范围的AMG是高丰度的蛋白家族，显示出在超过85%的样本中均有高频率分布，且不受季节性变化的影响。这些AMG蛋白家族主要参与硫代谢、辅助因子和叶酸的生物合成。并且，对于特定一些携带AMG的病毒物种，这些AMG在种群内的病毒基因组中往往都存在，显示出较高的种群内保有频率（图3f和扩展数据图3）。这些病毒辅助代谢有机硫和无机硫功能通常以硫化物作为最终的产物，进而有助于宿主的存活、生长、氨基酸合成、蛋白质功能及病毒粒子的组装（补充结果）。

相反，窄谱宿主范围的AMG揭示了执行特定功能的宿主范围较为有限的AMG蛋白家族（图3g和扩展数据图4）。这些AMG家族的例子包括psbA/D，其编码光系统II反应中心结构域D1/D2，这些AMG家族能够维持被感染蓝细菌的光合作用活性。先前的研究表明，蓝细菌噬菌体可通过解耦光合作用中的碳固定，或抑制卡尔文循环并改变宿主代谢，转向磷酸戊糖途径，以促进NADPH和脱氧核苷酸的生物合成。在我们的分析中，我们还发现了与磷酸戊糖途径相关的特定AMG家族，如gnd和zwf。其他例子包括crtG，它负责在Burkholderiaceae中产生抗氧化剂，从而减轻活性氧的压力，增强病毒细胞的整体适应性；以及inuJ，它编码一种酶，能够在Chitinophagaceae中将蔗糖水解为葡萄糖，可能作为一种能量保存机制以支持病毒的传播。

图3 | 与淡水病毒中的碳、氮和硫代谢相关的AMGs及AMGs的分布模式。

a, 参与光合作用的AMGs。b, 参与甲烷及相关代谢的AMGs。c, 参与氮代谢的AMGs。d, 参与CO2固定的AMGs。e, 参与硫代谢及相关代谢的AMGs。THF，四氢叶酸；APS，腺苷-5′-磷酸硫酸盐；PAPS，3′-磷腺苷-5′-磷酸硫酸盐；DMSP，二甲基硫代丙酯；SAM，S-腺苷甲硫氨酸；MTA，甲基硫腺苷；MTR，甲基硫核糖；dAdoMet，5′-去氧腺苷甲硫氨酸。基因符号以蓝色表示，并附有出现频次和丰度值（出现频次，指AMG蛋白家族出现在的宏基因组数量；丰度，指在含有该AMG蛋白家族的宏基因组中，携带该AMG蛋白家族的病毒的平均标准化丰度）。虚线箭头表示未由AMGs编码的步骤。每个AMG蛋白家族的详细信息见补充表6。AMG代谢及功能的完整图示见扩展数据图2。f, AMG蛋白家族的“丰度与出现频次”散点图。高出现频次指分布在超过400个宏基因组中的AMG蛋白家族。AMG蛋白家族的KO点标注了KO ID、基因名和相应的KEGG通路信息。AMG蛋白家族的丰度通过每个宏基因组中1亿条reads进行标准化。g, 宿主分类（科级别）的辛普森指数（Simpson Index）与AMG蛋白家族出现频次的相关性。低辛普森指数（窄谱宿主范围）与AMG蛋白家族出现频次的拟合曲线上标注了KEGG通路/功能信息（仅考虑分布在超过50个宏基因组中的AMG蛋白家族）。在f和g中，散点图展示了线性回归曲线及相应的方程和R²值，而阴影误差带表示回归线的95%置信区间。

AMG在病毒物种不同成员中的分布

为了探索AMG在病毒物种中的分布，我们分析了不同病毒种群成员中的AMG蛋白家族变化。结果表明，约30%的AMG 蛋白家族与物种组合具有高存在率（定义为在所有成员中的出现频率，位于前 75%-100% 四分位数区间），这表明这些AMG蛋白家族在病毒物种中广泛分布（扩展数据图 3a）。这一模式在物种大小（物种中病毒成员的多少）上保持稳定。

我们进一步关注了 AMG 存在率较高（75-100% 四分位数）的、拥有成员最多的物种（第 4 四分位数），发现这些物种中高存在率的 AMG 蛋白家族不仅其存在率超过 95%，而且具有更高的丰度（丰度定义为该蛋白家族在物种内所有成员携带总体AMG蛋白家族中的百分比），表明这些AMG蛋白家族在多个病毒携带样本中始终存在。同时，通过对20年时间序列的分析，我们发现这些高存在率 AMG蛋白家族在不同季节中始终出现（扩展数据图 3b）。

病毒-宿主动力学和病毒间竞争的季节性模式

结合 20 年的相对丰度数据，我们揭示了病毒和宿主丰度的季节性变化模式。我们分析了三类关键微生物群体：蓝细菌、甲烷氧化菌和纳米远洋菌（放线杆菌门中的超小 acI类群）。在我们的分析中，病毒丰度包括含有AMG和不含AMG的病毒（图 4）。在检查的13个AMG蛋白家族中，当病毒基因组的完整性较高（75-100%）时，大多数物种成员都包含相应的AMG蛋白家族（>85%）（图 4a），这一结果强调了含AMG的物种代表性成员在所有含AMG病毒中的代表性。

在分析的三组蓝细菌中，包括浮游丝藻（属水平）、微囊藻（属水平）和蓝藻科（科水平），宿主与病毒丰度之间呈正相关（图 4b）。此外，这些病毒（尤其是那些不含 AMG 的组分）与宿主的丰度峰值时间点在20年的周期中呈现一致模式。以 Planktothrix （浮游丝藻）为例，其病毒丰度的高峰比宿主的高峰滞后约 20 天，而微囊藻和蓝藻科则表现出病毒与宿主丰度的同步性。先前的研究表明，宿主生理状态与栖息环境控制可能影响病毒后代的产生，且快速生长的宿主为病毒的繁殖提供了更多资源。因此，浮游丝藻病毒种群的滞后现象可以合理地解释为宿主在年度生长周期初期达到显著丰度时，病毒可以进行大量复制。这一同步现象表明，光照与营养资源的重叠生态位中可能存在潜在的竞争，病毒和宿主都在其中发挥积极作用。

与蓝细菌的模式类似，四个嗜甲烷菌属也显示出宿主和病毒丰度之间的正相关关系，并呈现季节性丰度变化（图 4c）。值得注意的是，UBA10906 属的丰度超过了其他三个属，且其丰度高峰出现在夏末至秋季，持续时间也较长。特别是，含 pmoC 基因的Methylocystis（甲基孢子菌）病毒与其宿主的丰度比，类似于不含 pmoC 的病毒与宿主丰度比。相比之下，其他三个属的病毒种群相对一致，即含 pmoC 的病毒丰度比不含 pmoC 的低一个数量级。根据文献报告，病毒编码的 pmoC 可能有助于增强有氧甲烷氧化的能力。早期的土壤研究表明，甲基孢子菌病毒在13C-CH4 驱动的土壤培养物中接收 CH4 衍生碳的丰度最高。这可能预示着相比与其他两类甲烷氧化菌病毒，甲基孢子菌病毒中的pmoC可能更能被用来提高甲烷的代谢利用效率，因此含有pmoC的甲基孢子菌病毒丰度相对较高。

同样，两个 Nanopelagicales 属（acI 类群）显示出宿主与病毒丰度的正相关关系（图 4d）。夏季Planktophila的丰度可能受到抑制，这可能是由于在该时期达到高峰的非生物的光化学作用以及生物的蓝藻和藻类代谢产生了高浓度的过氧化氢（H2O2）。此种抑制导致Planktophila种群的显著下降。虽然由 katG 编码的过氧化氢酶对降低 H2O2 水平和稳定Planktophila生长至关重要，但侵染Planktophila的含 katG 病毒的丰度较低，表明它们不足以增强过氧化氢酶活性来对抗高 H2O2水平带来的压力。此外，血红素是过氧化氢酶产生的重要辅助因子。含 ahbD 基因的Planktophila病毒丰度在夏末和秋季呈下降趋势（数据未显示），提示了病毒辅助的血红素合成的限制，以及其对于过氧化氢酶合成的影响。因此，尽管这些病毒存在，夏季高浓度的H2O2可能是导致Planktophila丰度下降的重要原因。

在这三个具有重要生物地球化学作用的宿主群体中，含AMG病毒与宿主的比值始终低于不含AMG病毒与宿主的比值 1 到 2 个数量级。考虑到大多数早期研究并未评估自然界中含 AMG 病毒的丰度，可能过度强调了病毒 AMG 与特定底物代谢（如甲烷利用中嗜甲烷菌的 pmoC）或增强限速酶（如蓝细菌的 psbA 以优化光合作用）的关系。此外，我们认为先前认为含有AMG 的病毒在群落中更普遍和重要的观点，可能来源于开放海洋和其他海洋环境中分离的病毒及宏基因组。例如，几乎所有感染蓝细菌的肌尾噬菌体和超过一半的短尾噬菌体在其基因组中被认为含有 psbA 基因，从全球海洋采样考察数据集中招募的 89% 蓝藻短尾噬菌体scaffold中包含 psbA。然而，根据本研究的结果，观察到的相对丰度显示不含 AMG 的病毒主导了病毒群落，并且其丰度紧密反映宿主的季节性波动。这意味着不含 AMG 的病毒占据了病毒群落的主导地位。综上所述，我们建议对病毒的适应性、代谢、生态系统功能、生物地球化学以及其对宿主适应的影响进行重新评估，并强调进一步研究不含 AMG 病毒与宿主之间相互作用的重要性。

图4 | 蓝细菌、甲烷氧化菌和纳米浮游目的病毒-宿主相关性和季节变化模式。

a，条形图，表示病毒基因组完整性与含有AMG的种属成员百分比的比较。考虑了具有代表性基因组（含相应AMG）的种属。b，蓝藻类群病毒和宿主丰度的季节变化。第一张折线图描述了蓝藻科、微囊藻属和浮游丝藻属的病毒和宿主的丰度。各条线表示从以5天为间隔计算的内插值得到的平均丰度。第二张图描述了蓝藻科、微囊藻属、浮游丝藻属和其他蓝藻在季节变化中的丰度分数。第三个箱形图描绘了所有时间点（生物学重复次数n=241、330、106）蓝藻科、微囊藻属和浮游丝藻属的病毒/宿主丰度比。c, 甲烷氧化菌属的病毒和宿主丰度的季节性变化。第一个线形图描述了四个甲烷氧化菌属的病毒和宿主的丰度。第二个箱形图描述了四个甲烷氧化菌属的病毒/宿主丰度比（生物学重复数n=81、50、32、75）。d, 病毒和寄主的季节性变化。第一个线形图描述了两个Nanopelagicales属的病毒和宿主的丰度。第二个箱形图描述了两个Nanopelagicales属的病毒/宿主丰度比（生物学重复数n=113，615）。b、c和d的每个折线图顶部的条形图表示相应季节（20年的生物重复次数n=20）开始日期的平均值和标准差。b、c和d内的箱形图显示了中位数（中线）、平均值（带标记值的暗红色点）、四分位距（从第25百分位数至第75百分位数）、须线和离群值。

随时间变化病毒对AMG库的贡献很大

为了更好地了解生物化学重要病毒群体的生态和进化作用，我们分析了病毒种代表基因组的覆盖率。与AMG蛋白家族丰度的季节性模式（补充数据集1）一致，含有psbA的病毒种在夏末达到峰值（补充表7），因此我们选择夏末作为每年的代表性时间点。

时间序列数据显示，四种含psbA的病毒物种在20年中持续了15年或更长时间（扩展数据图5a）。然而，这些持续性物种就AMG丰度来讲并不是最高的。四个中只有两个具有高AMG丰度（≥10%）。类似地，高存在率的含pmoC、katG和ahbD的病毒种与高AMG丰度的病毒种不同（除了一种含katG的病毒种和两种含ahbD的病毒种）（扩展数据图5b-d）。这表明含有AMG的持续性物种通常不是每年丰度最高的;相反，AMG库是由每年波动的物种驱动的。由于AMG调节关键的宿主功能，这些发现表明，随时间变化的病毒种类可能在关键的生物地球化学过程中发挥重要作用，如光合作用和甲烷氧化。

图5 | 持续性病毒种群的微多样性变化。

a, SNP等位基因频率变异模式。SNP等位基因根据20年内的平均等位基因频率以升序排列，每行表示单个SNP。基因组中的平均等位基因频率相应地标记在每列下方。等位基因频率通过与参考等位基因（2018年相应病毒基因组中的主要等位基因）对齐的reads比例来描述。b, 基因频率变化模式。y轴代表基因频率，通过将基因覆盖率除以基因组内所有其他基因的平均覆盖率来确定。2000-2003年和2016-2019年之间平均频率变化≥1.0的基因被视为频率显著增加或减少。无有意义的基因频率值的间隔在图中用虚线表示。

病毒持续性与进化进程和软性基因组范围选择扫荡（soft genome-wide sweep）有关

为了检查持续性病毒物种之间的种群内多样性（intra-population diversity），我们研究了具有AMG的病毒物种，AMG编码四种重要功能（psbA用于光合作用，pmoC用于甲烷氧化，katG用于减少H2O2胁迫和ahbD用于血红素合成）（补充表7和补充结果）。我们在每个核苷酸的基础上研究了病毒scaffold的标准化丰度（详见方法）。在我们对471个宏基因组的分析中，六种含有psbA的病毒物种中的四种显示出物种丰度与核苷酸多样性之间的正相关性（P

随后，我们扩展了分析范围，以涵盖所有含AMG的病毒种属。其中，865个有效核苷酸多样性结果中的221个和776个有效SNP密度结果中的262个分别与病毒丰度呈显著正相关。相比之下，865个具有有效核苷酸多样性结果的物种中仅23个和776个具有有效SNP密度结果的物种中仅12个分别显示出与病毒丰度的显著负相关性（补充表8）。这些发现表明，病毒群体内多样性主要受中性理论支配，其中群体大小的增加通常导致核苷酸多样性和SNP密度的增加。这些持续存在的病毒群体中的阳性选择基因（补充表9）编码酶类与嘌呤生物合成、病毒RNA合成、DNA修复、控制细胞和病毒DNA和信使RNA周转、转录调节和细菌细胞壁穿透以及与辅助代谢功能如光合作用（psbA）、血红素合成（ahbD）和叶酸生物合成（moaA）等相关。这样的发现表明了与病毒感染和宿主调节、病毒体复制和宿主代谢重定向或增强相关的病毒适应性选择机制。

在某些病毒种中，全基因组遗传异质性逐渐降低（图5a），如线性回归（高回归斜率）和斯皮尔曼秩（Spearman’s rank correlation analysis）相关检验（显著P值）所示，持续性含psbA和ahbD的病毒种显示SNP等位基因频率随时间增加（补充表10）。我们检查了含有这些频率增加的SNP等位基因（allele）的基因。在这两个vMAG中，9个病毒基因中有6个被阳性选择；3个被注释有重要功能（psbA和ahbD用于辅助代谢，限制性内切酶II型样基因用于宿主基因组降解，核苷酸再循环用于病毒复制和排除重叠感染），有助于病毒适应性。这表明，虽然这些高存在率的病毒物种随着时间的推移而持续存在，但它们的亚群已经发生了变化。具体来说，选择有利于一些包含等位基因的亚种群。然而，基因组内的平均等位基因频率仍然相对较低（~0.7），这意味着全基因组扫荡仍在进行中，或者病毒群体经历了软性扫荡，在这个过程当中，选择有利于大型且多样种群中少数的亚种群。相比于细菌，噬菌体通常具有较高的基因组多样性和重组率。由于在本研究开始前就存在较高的微多样性（microdiversity），具有选择优势的亚种群替代原种群需要更长的时间。同时，高重组率似乎可以抵消选择，促进具有不同微生态位的亚群之间的重组，从而保留全基因组多样性。

此外，对于某些病毒群体，某些基因的基因频率随时间增加或减少（图5b和补充表11）。增加频率的基因库编码结构蛋白，如内切唾液酸酶的伴侣（用于病毒初始吸收到宿主中的尾纤维蛋白）、基板、基板楔和尾管蛋白；病毒核心功能蛋白，如含纤连蛋白III型蛋白质（可能用于病毒-细胞表面相互作用）和细胞壁水解酶（用于宿主细胞壁降解和促进细菌溶解和病毒体释放）和AMG蛋白（PmoC）。这表明病毒结构蛋白、病毒感染蛋白和辅助代谢蛋白在增强病毒适应性中的重要性。这种情况表明了一种类似的全基因组选择模式，即在本研究之前（2000年之前）在湖泊中携带重要功能基因的某些亚群从2000年到2019年逐渐在种群中占主导地位。总的来说，尽管病毒群体具有高水平的多样性和重组率，但对具有适应性优势的基因的选择和全基因组选择仍然在病毒群体动态中发挥重要作用。

环境约束通过自上而下（top-down）和自下而上（bottom-up）的控制塑造病毒群落

宿主动态由“自上而下”（例如，原生生物的放牧、病毒裂解）和“自下而上”（例如，水温、营养浓度）的驱动因素控制。我们希望这些动态也体现在测量的病毒丰度和潜在的病毒作用。我们专注于蓝细菌和它们的病毒，以探索可用的湖沼测量数据是否可以解释它们的动态。利用斯皮尔曼秩相关检验，分析了蓝藻和蓝藻病毒丰度>20%峰值的持续天数与环境参数的关系。持续天数可以反映夏季环境条件的综合影响。正如预期的那样，水温和Secchi深度（水透明度的测量）与蓝细菌及其病毒呈正相关（图6a和补充表12）

这些关系反映了自上而下和自下而上因素的复杂平衡，这些因素塑造了生态系统中的环境、病毒、细菌和捕食者关系。磷作为一种自下而上的因素，刺激浮游植物生长。这种浮游植物生物量的增加为进一步的生态相互作用奠定了基础。无机碳通过光合自养作用成为蓝藻的主要碳源，并以自下而上的方式促进蓝藻和病毒的增殖。此外，几种蓝藻在光合作用过程中可以同时同化有机碳，混合营养代谢促进了蓝藻的生长。这与观察到的有机碳和蓝藻之间的正相关性一致（图6b）。氨氮与蓝藻病毒丰度也呈正相关。作为蓝藻同化的主要氮源，它促进蓝藻的生长，进而支持蓝藻病毒的增殖。相应的，还有自上而下的控制，随着蓝藻丰度的增加，浮游动物密度也随之增加，表现出典型的捕食-被捕食动态。蓝藻丰度的增加为蓝藻病毒提供了更多的宿主，这导致病毒丰度的升高，这从观察到的病毒与宿主丰度的相关性中可以明显看出。这些自上而下的相互作用对调节生态系统内的种群至关重要。

图6 | 病毒、宿主和环境参数在时间序列中的相关性。

a, 热图表示环境参数与蓝藻、蓝藻病毒、浮游植物生物量浓度和浮游动物密度之间的Spearman秩相关关系。通过计算Spearman秩相关系数评估两组数据之间的关系，并采用双尾检验确定显著性。在单元格中标注了Spearman秩相关系数，显著性水平用网格边框表示：黑色边框表示P

讨论Discussion

我们的研究强调了在一个单一的温带淡水湖中发现的大量未知病毒多样性，并进一步表明其他淡水系统，如热带湖泊，可能是病毒的供应者，在营养和生物地球化学转化中发挥重要作用，需要进一步调查。

很少有研究专注于病毒群体动态的演化和环境分析，尤其是在像本研究这样长达20年的自然环境时间序列研究中。从我们的研究中发现，高存在率的持续分布病毒群体经历了基因的正向选择和全基因组选择。我们推测出了三种演化过程：选择偏向与适应性相关的基因，基因组异质性随时间下降，以及携带特定基因的亚种群成为优势种群。类似于某湖泊中绿硫细菌种群的演化过程，在该种群中，SNP 变异会被缓慢清除，一些基因会随着时间的推移在群体中被清除或失去，我们的研究表明，这些演化过程在病毒和微生物中具有普遍性。这些过程可以用以下概念共同解释：某些通过突变或水平基因转移获得优势特征的亚种群，通过竞争胜出，成为观察到的种群中的主要组成部分。而从宏观多样性视角看，这些种群似乎是“稳定的”。

在病毒和宿主之间的进化军备竞赛中，“杀死赢家”（Kill the winner）和其他形式的动态经常发生，导致各种病毒株丰度的波动。尽管存在这些波动，但某些病毒物种会持续很长一段时间，并随着时间的推移显示出高存在率，这表明它们在适应不断变化的环境条件方面取得了进化上的成功。这些高存在率的病毒物种可能代表了用于解释赢家动态的模型中的“皇家家族”病毒物种，其中具有增强病毒适应性的某些亚种群的后代在随后的赢家周期中成为主导。这些高存在率的病毒种可能在粗多样性（macrodiversity）水平上保持稳定存在，同时在微多样性（microdiversity）水平上经历连续的基因组和生理变化。例如，与抗性和反抗性相关的病毒基因的选择导致细菌细胞壁渗透、宿主细胞的初始吸收和病毒-细胞表面相互作用的增强。因此，随着时间的推移，病毒和宿主的持续相互作用和共同进化表明高度丰富的病毒物种更好地适应当地环境条件。

同时，我们确定了环境因素，如无机碳和铵，可能通过病毒-宿主相互作用间接影响病毒丰度。我们的观察表明病毒和环境间复杂的相互作用，包括自下而上的控制，如营养物质的可用性和初级生产，和自上而下的控制，如捕食者-猎物动态。总体而言，我们的研究结果强调了进一步研究微生物组和生态系统中病毒的必要性，以及将病毒研究置于生物多样性、病毒-宿主相互作用和自然环境中存在的物理化学限制的更广泛背景下的整体方法。

作者简介

深圳大学高研院特聘教授周之超博士是本文的第一作者，威斯康星大学麦迪逊分校细菌学系的副教授Karthik Anantharaman 博士为本文的通讯作者。

周之超（第一作者）

周之超，深圳大学高等研究院特聘教授、博导，于武汉大学和香港大学分别获得本科和博士学位，2017-2023年分别在香港中文大学、美国威斯康星大学做博士后和助理科学家，研究方向为深海热液微生物组及病毒组研究。在环境微生物/病毒组学分析方法、微生物/病毒碳硫循环等取得了一系列成果，共发表50+篇SCI论文（一作/共一20+篇），包括发表在Nature Microbiology，Nature Reviews Microbiology，The ISME Journal（4），Nature Communications（1共一），Microbiome（1共一，1一作），FEMS Microbiology Reviews等著名杂志, H指数28，引用近4000次。获得2024年海外优青、海洋强国青年科学家提名和广东省珠江人才青年学者等奖励。曾担任武大威州校友会会长、湖北高校海外校友会联盟主席团成员。

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Karthik Anantharaman （通讯作者）

Karthik Anantharaman 是威斯康星大学麦迪逊分校细菌学系副教授，主要研究微生物与病毒生态学，以及其在生物地球化学循环中的作用。他于2007年获得印度卡纳塔克邦国立理工学院土木工程学士学位，2014年在密歇根大学获得地球与环境科学博士学位，研究深海热液喷口微生物群落。在加州大学伯克利分校博士后研究期间，研究深海热液喷口微生物群落。在加州大学伯克利分校博士后研究期间（Jill Banfield课题组），他利用高分辨率宏基因组学探究了地下生态系统的微生物生物地球化学过程。

Anantharaman 教授的研究横跨微生物生态学、病毒学和基因组学领域，结合计算、实验和现场研究，开发并应用前沿计算方法研究自然界中的病毒生态与相互作用。他曾获多项重要荣誉，包括美国国家科学基金会（NSF）CAREER 奖、美国国立卫生研究院（NIH）MIRA 奖、美国微生物学会（ASM）早期职业环境微生物学研究奖，并于2023年入选科睿唯安全球高被引科学家名单。他开发了挖掘宏基因组数据以表征病毒特征（VIBRANT、vRhyme、PropagAtE、ViWrap、vClassifier、Protein Set Transformer）以及研究微生物代谢和微生物组的相互作用（METABOLIC）的许多著名软件。

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来源：微生物组