摘要：自2019年12月起，由SARS-CoV-2引发的新冠疫情在全球迅速传播，对公共卫生和经济破坏严重，且病毒变体不断涌现，现有疫苗和药物对部分变体效力降低，因此仍需研发有效、安全、便捷的抗 SARS-CoV-2 药物。抑制病毒复制的关键是阻断其生命周期步骤，依赖

自2019年12月起，由SARS-CoV-2引发的新冠疫情在全球迅速传播，对公共卫生和经济破坏严重，且病毒变体不断涌现，现有疫苗和药物对部分变体效力降低，因此仍需研发有效、安全、便捷的抗 SARS-CoV-2 药物。抑制病毒复制的关键是阻断其生命周期步骤，依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp，也称为nsp12）催化病毒RNA的合成，是发现抗冠状病毒感染药物的重要靶点。

2025年1月13日，郑州大学于文全团队和常俊标团队合作，在JMC期刊上发表了题为“Discovery of a 2′-α-Fluoro-2′-β-C-(fluoromethyl) Purine Nucleotide Prodrug as a Potential Oral Anti-SARS-CoV-2 Agent”的论文。

核苷类似物（NAs） 在抗病毒药物研发中发挥着重要作用。截至目前，已有几种核苷类似物药物获批用于临床治疗SARS-CoV-2感染，包括瑞德西韦、莫努匹韦、阿兹夫定和 VV116（图1）。研究团队对一系列 2'-α-氟-2'-β-C-（氟甲基）修饰的嘌呤核苷类似物前药进行了初步筛选，并确定了具有强效抗SARS-CoV-2活性的化合物15（图1）。该研究报告了这种候选化合物作为一种新型RdRp 抑制剂用于治疗SARS-CoV-2感染的合成及生物学评估。

图1. 获批抗SARS-CoV-2药物及化合物15的化学结构

新冠病毒的中央复制转录复合体（C-RTC，nsp12-nsp7-nsp82）所催化的体外RNA合成，能被相应的生物活性核苷三磷酸（13-TP）有效抑制。同时，C-RTC:13-TP 复合体的冷冻电镜结构也已被测定。

化合物15对新冠病毒20SF107毒株（半数有效浓度 EC50 = 0.56 ± 0.06 μM）和奥密克戎BA.5变体（EC50 = 0.96 ± 0.23 μM）展现出强大的体外抗病毒活性，且细胞毒性较低。此外，大鼠对高达 2000 mg/kg 剂量的该化合物耐受性良好，单剂量口服 40 mg/kg 的这种前药，可在大鼠的靶器官肺部产生高浓度的13-TP，且半衰期较长。

这些研究结果支持将化合物15进一步开发为一种可口服的抗病毒药物，用于治疗新冠病毒感染。

研究内容

化学合成

Scheme 1. 核苷类似物13的逆合成分析

Scheme 2. 核苷类似物13 及其前药15的合成

Scheme 3. 核苷三磷酸（NTP）13-TP 的合成

对RdRp催化的体外RNA合成的抑制作用

本研究设计并合成了一种靶向 RdRp 的新型核苷酸类似物，并测定了新冠病毒中央复制转录复合体（C-RTC，nsp12-nsp7-nsp82）与新型抗病毒药物 13-TP 结合的冷冻电镜（cryo-EM）结构。

13-TP的加入有效抑制了RNA聚合活性（图2）。在5 mM NTPs存在下，3 mM 13-TP完全抑制了RdRp的聚合活性。此外，30 μM-13-TP阻断了部分引物RNA的完全延伸（图2A）。最后，当无 NTPs 时，13-TP被纳入产物链并终止链延伸（图2B）。

图2. 13-TP 对 C-RTC 催化的体外RNA合成的抑制作用

(A, B) 13-TP 在有 5 mM NTPs（A）或无 NTPs（B）的情况下，对 C - RTC 催化的体外 RNA 合成的抑制作用。

C-RTC:13-TP复合物的结构

C-RTC:13-TP 复合物结构包含一个 nsp12、一个 nsp7、两个 nsp8、模板链中的11碱基RNA、引物链中的10碱基RNA、与引物链共价相连的抑制剂13-MP（图3）及一个可能充当催化离子的镁离子（图3D）。双链RNA螺旋由 nsp8 和 nsp12 的指-掌-拇指结构域固定，模板-引物RNA与nsp12有广泛相互作用，共有33个nsp12 残基直接参与RNA结合（图4）。

13-MP位于引物链3'端，在-1位置共价掺入引物链（图3B）。13-TP浓度高时引物延伸立即终止，化合物15通过非强制RNA 链终止机制抑制病毒 RdRp 活性，需母体药物转化为活性三磷酸形式。

SARS-CoV-2 RdRp催化活性位点由保守基序 A-G 组成，基序A-D在手掌结构域，759-SDD-761序列构成催化活性中心。基序F和G在手指结构域，与模板链和引物链RNA相互作用（图4A）。参与 RNA 结合和构成催化活性位点的残基高度保守，表明开发广谱抗病毒抑制剂或许可行。

13-TP位于催化活性位点的中心（图4A），13-MP作为单磷酸腺苷类似物，与引物链上游碱基形成碱基堆积、与模板链尿嘧啶碱基形成两个氢键（图3D和图4B），其核糖与S759、D760、D761侧链相互作用，氟修饰与S759、D760相连，C813羟基和S814侧链与13-MP磷酸二酯主链形成氢键，附近镁离子与磷酸二酯主链相互作用，是催化活性位点一部分（图3D）。

图3. C-RTC:13-TP 复合体的结构（PDB：9L09）

(A) C-RTC:13-TP中各组分的结构域组成。(B) C-RTC:13-TP 复合体中使用的 RNA 支架结构。(C) C-RTC:13-TP的整体结构三视图。(D) 覆盖 13-MP 和部分 RNA 核苷酸的冷冻电镜密度图。

图4. RNA与新冠病毒 RdRp之间的相互作用

(A) 引物或模板与RdRp之间的相互作用；(B) RNA与RdRp之间详细相互作用的示意图。

体外抗SARS-CoV-2活性研究

用CCK8法在人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）和Vero细胞中测定前药15的细胞毒性，发现其明显优于瑞德西韦；另外通过实验证实，化合物15以剂量依赖方式抑制SARS-CoV-2病毒复制及N蛋白表达，对不同毒株有低EC50。

图5. 化合物15在HPAEpiC 中的细胞毒性及抗 SARS-CoV-2活性

(A, B) 化合物15（A）和瑞德西韦（B）在HPAEpiC细胞中的细胞毒性；(C, D) 化合物15（C）和瑞德西韦（D）对SARS-CoV-2毒株20SF107的抗病毒活性；(E) 化合物15对SARS-CoV-2 奥密克戎BA.5 变异株的抗病毒活性； (F) 化合物15对SARS-CoV-2 N 蛋白表达的抑制作用。

小鼠体内抗SARS-CoV-2疗效评估

对10周龄的K18 - hACE2 小鼠接种奥密克戎 BA.5 毒株后用化合物 15 治疗，其呈剂量依赖保护作用，高剂量组小鼠体重保持稳定，生存率达到100%。

图6. 化合物15在小鼠体内抗 SARS-CoV-2 的功效

(A) 化合物15对小鼠体重变化的影响；(B) 化合物15对小鼠存活率的影响。

大鼠急性毒性评估

对Sprague- Dawley (SD) 大鼠开展前药15急性毒性评估，分组给予不同剂量药物或赋形剂，14 天观察期无死亡及显著副作用，各指标无差异，主要器官未受损，耐受性良好。

图7. 经灌胃给予前药1 后大鼠的平均体重变化情况

大鼠肺部生物活性 13-TP 水平的测定

测定SD大鼠肺部13-TP水平以评估前药15形成13-TP能力，结果表明，化合物15能够有效地被吸收入体循环，并最终在肺部产生高暴露量的生物活性代谢物（13-TP）。

表1. 大鼠口服40mg/kg化合物15后，肺部13-TP水平的平均药代动力学参数

图8. 口服前药15后大鼠肺部活性 NTP 13-TP 的水平

总结

研究团队设计合成了一种新型2'-α-氟-2'-β-C-（氟甲基）嘌呤核苷酸类似物13及其前药15。发现具有生物活性的13-TP是新冠病毒RdRp的抑制剂，解析了其与C-RTC结合的冷冻电镜结构。化合物15对两种新冠病毒毒株抗病毒活性强、细胞毒性低，有望进一步开发为口服抗新冠药物。

冷冻电镜（cryo-EM）在该研究中起到了至关重要的作用，通过cryo-EM，使得研究人员能够精准地捕捉到C-RTC:13-TP复合体的三维结构，深入理解了该复合物的组装和功能，这对于开发更高效、具有广谱抗病毒活性的药物具有重要意义。

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