摘要：在医学研究的前沿，科学家们正在以前所未有的精度探索大脑老化的机制。最近，《Nature》发表的一项研究《Spatial transcriptomic clocks reveal cell proximity effects in brain ageing》引入

转自：生物谷

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导读

在医学研究的前沿，科学家们正在以前所未有的精度探索大脑老化的机制。最近，《Nature》发表的一项研究《Spatial transcriptomic clocks reveal cell proximity effects in brain ageing》引入了“空间转录组学”（Spatial Transcriptomics）概念，它不仅能够以单细胞分辨率展示大脑内不同细胞类型的空间分布及其基因表达特征，还能捕捉这些细胞随时间的变化规律。本文将聚焦于这项技术的核心原理、应用实例及其在临床实践中的潜在价值。

研究背景

大脑老化是许多神经退行性疾病的重要风险因素之一，如阿尔茨海默病和帕金森病。随着年龄的增长，大脑中的干细胞活性减弱，新生神经元的数量减少，导致认知功能下降。为了更好地理解这一过程，研究人员利用先进的基因表达分析工具——空间转录组学——一种能够在组织切片中定位单个细胞并测量其基因表达水平的技术。通过这种方法，可以绘制出高分辨率的大脑图谱，显示出不同类型的细胞在特定位置上的分布情况及其随时间的变化趋势。

研究设计与结果

在这项开创性的研究里，科学家们收集了来自雄性小鼠的冠状面和矢状面脑切片，覆盖了从出生到老年的20个不同年龄阶段。使用MERFISH技术，他们获得了每个切片上所有细胞的基因表达情况。基于此，团队开发了一套名为“空间转录组学时钟”的计算模型，用于评估每个细胞的老化程度。结果显示，老年个体大脑中某些特定区域存在异常活跃的免疫细胞群，尤其是T细胞，暗示着非神经元细胞在脑老化过程中也扮演着重要角色。

此外，研究人员还探讨了运动和部分重编程这两种干预措施对于逆转脑老化的影响。实验发现，经过适度锻炼或基因编辑处理后的小鼠大脑中，一些关键区域显示出明显的年轻化迹象。例如，亚室带区内的新生神经元数量显著增加，同时周围环境得到改善，表明新生细胞可能对其它成熟细胞产生积极影响。

研究人员通过多路抗错荧光原位杂交（MERFISH）技术，对20个不同年龄的雄性小鼠冠状脑切片及6个不同年龄的小鼠矢状脑切片进行了分析。测量了300个基因的转录本，生成了高分辨率的空间转录组数据（图1a）。

利用预定义的标记基因，成功识别了18种不同的细胞类型，其中包括神经元细胞类型：兴奋性神经元（Neuron-excitatory）、抑制性神经元（Neuron-inhibitory） 和中层小胶质细胞（Neuron-MSN）；星形胶质细胞（Astrocyte）、少突胶质细胞（Oligodendrocyte）和少突胶质前体细胞（OPC）；定位到侧脑室（VEN），包含神经发生区的细胞类型：神经干细胞（NSC）、神经母细胞和室管膜细胞；参与大脑血管系统的细胞类型：内皮细胞、周细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）和血管硬脊膜细胞（VLMC）；免疫细胞类型：驻留于大脑的微胶质细胞（microglia）、T 细胞、B 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。

此外，研究人员还根据细胞邻域丰度聚类注释了七个解剖亚区，最终将其手动分为四个主要区域，分别是（1）胼胝体和前连合白质纤维束；（2）CTX层1、皮质下膜和脑室上皮层，CTX层2/3 ，CTX层4/5/6；（3）尾状核及其相邻区域（STR）；和（4）VEN 。这一分类为后续分析提供了坚实的基础图（图1b）。

细胞比例随年龄变化的趋势随着年龄的增长，大脑皮层中胶质细胞、少突胶质细胞和T淋巴细胞的比例显著增加，而神经前体细胞、干细胞和神经元祖细胞的比例则明显减少。特别是T淋巴细胞在整个采样区域内广泛分布且数量随年龄增长显著增多；相比之下，神经干细胞（NSC）主要集中于侧脑室，其比例在整个生命周期内持续下降。这种变化趋势揭示了衰老过程中细胞类型比例的重要转变（图1c-d）。小胶质细胞拥有最丰富的年龄相关基因，其中编码PD-1的Pdcd1是上调幅度最大的基因之一，而编码Fc受体样分子的Fcrls则是下调幅度最大的基因之一（图1e）。

研究人员对每个组合中的所有20个年龄中每个基因、细胞类型和空间亚区域的基因表达轨迹进行了聚类分析，识别出了九种不同的簇，代表基因表达轨迹的原型（图1f-g）。

进一步分析了基因表达的空间和时间轨迹，干扰素反应基因Stat1几乎在所有细胞类型和亚区域内都显示了“逐渐增加”的轨迹；相反，参与肌酸合成的基因Gamt普遍表现为随着年龄增长而“逐渐减少”的轨迹。此外，基因表达可以直接可视化在脑切片上，确认了基因表达的细胞类型特异性和区域特异性变化（图1h-i）。

综上所述，研究者构建了一个详尽的大脑衰老时空转录组图谱，揭示了衰老过程中细胞类型比例和基因表达模式的重大变化。

为了精确测量单个细胞的生物年龄，研究人员开发了一种名为“空间衰老时钟”的机器学习模型。该模型基于小鼠大脑的空间预处理基因表达数据训练而成，旨在预测每个细胞的实际生理年龄。为了在保持高精度的同时保留空间信息，研究团队引入了一种创新的软性空间伪聚类程序——SpatialSmooth。这一方法通过迭代地对同一类型细胞的邻近细胞进行基因表达值的平滑处理，从而优化了特定细胞类型的衰老时钟模型训练（图2a）。

使用SpatialSmooth方法，在冠状切片数据集上开发的空间衰老时钟在18种细胞类型中的14种中表现出高精度（R>0.7），包括罕见的T细胞、神经干细胞（NSC）和神经元祖细胞（图2b）等。相比于直接在冠状切片数据集的空间单细胞转录组中训练的其他时钟模型，SpatialSmooth训练的空间衰老时钟表现出了显著优势（图2c）。进一步地，该模型在一组独立的MERFISH数据集中也展示了稳健性，成功分离了年轻、中年和老年三个年龄段的小鼠脑样本（图2d）。

值得注意的是，这些空间衰老时钟不仅适用于冠状脑切片，还能推广到矢状面脑切片，包括那些在冠状切片中不存在的区域，如嗅球和小脑（图2e）。此外，该模型还能够在仅部分基因重叠的情况下，对独立的啮齿动物队列进行外推，并且可以跨性别、跨脑区以及跨不同的单细胞转录组技术进行应用（图2f）。这些特性证明了空间衰老时钟的强大泛化能力和广泛的适用范围。

研究人员利用“空间衰老时钟”探索了其作为评估大脑不同细胞类型和区域对再生干预反应的可扩展工具的可能性。为此，生成了额外的MERFISH空间转录组学数据集，并测试了两种抗衰老干预措施：自愿运动和部分重新编程（即周期性表达山中因子Oct4、Sox2、Klf4和Myc）的效果（图3a）。

运动干预数据集涵盖了超过90万个细胞，分为18种类型（图3b）。空间衰老时钟显示，运动显著重新激活了几种细胞类型的转录组，特别是内皮细胞（中位数为4.9个月）、周细胞（3.4个月）和血管平滑肌细胞（4.7个月）（图3d）。基因集富集分析表明，运动后下调的基因在再激活区内皮细胞中显著富集于细胞连接和焦点粘附过程，提示运动对特定脑区内皮细胞的区域性再激活。神经祖细胞也表现出区域性再激活，尤其在靠近胼胝体（CC）的地方，这可能归因于该区域存在特殊的生长因子（图3f）。

部分重编程干预数据集包括超过一百万个细胞，分为15种类型（图3c）。空间衰老时钟揭示，部分重编程能够逆转少数细胞类型的转录组，如神经干细胞（中位数为2.7个月）和神经母细胞（2.8个月），这与恢复神经祖细胞的功能相一致（图3e）。室管膜细胞在CC附近显示出区域特异性逆转，而在VEN或STR附近未见此现象（图3g）。然而，其他细胞类型（如多巴胺能神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞）则表现出提前衰老反应，表明部分重编程对大脑既有有益也有潜在有害的影响，具体取决于细胞类型。

研究人员还分析了一个公开的MERFISH数据集，其中包含小鼠接受脂多糖（LPS）全身性炎症挑战后的CTX、STR和CC区域（图3h）。空间衰老时钟显示，几种细胞类型（包括胶质细胞、微胶质细胞）对LPS表现出加速衰老反应，特别是在皮层区域的星形胶质细胞和多个脑区的少突胶质细胞、OPC和微胶质细胞（图3i）。

另一个公开的STARmap数据集来自Tau/PS2/APP三重转基因阿尔茨海默病小鼠模型的海马体切片（图3h）。结果显示，大多数细胞类型（如小胶质细胞、神经元和大脑血管细胞）在多个脑区中表现出加速的转录衰老（图3j）。

综上所述，空间衰老时钟不仅揭示了两种不同抗衰老干预措施对特定细胞类型和区域的影响，还展示了其在评估炎症、神经退行性疾病和脱髓鞘损伤对大脑影响方面的潜力。

研究人员利用空间衰老时钟，量化了特定“效应”细胞类型对“目标”细胞类型的衰老影响。通过分析给定效应细胞的空间接近度如何改变目标细胞的预测年龄（图4a），研究团队识别出了214种不同的细胞-细胞邻近效应（图4b）。特别关注那些对邻近细胞有最强全局影响的效应细胞。结果显示，T细胞具有最强的平均亲和力效应（图4c），尤其在少突胶质细胞和内皮细胞中表现出显著的促进衰老作用（图4b）。

相反，神经干细胞（NSC）展示了最强的促年轻化平均亲和力效应（图4c），这在少突胶质前体细胞（OPC）和内皮细胞上尤为明显（图4b）。为了验证这些观察结果不是由于年龄相关的细胞类型比例变化引起，研究人员在每个样本子区域内随机置换所有细胞的空间位置。结果表明，这种随机化完全消除了所有效应细胞类型的邻近效应（图4c），证明了细胞类型比例或区域异质性不会显著影响邻近效应的大小。

为了进一步理解特定细胞在其邻近细胞中的作用，研究人员进行了虚拟细胞类型扰动实验，使用深度学习方法训练了一个图神经网络（GNN）模型。该模型基于中心细胞周围的局部细胞图来预测邻域衰老，定义为附近细胞平均年龄加速，仅依赖于细胞类型和图形连通性作为特征（图4d）。通过交换中心细胞的细胞类型并测量对邻域衰老的影响，研究发现：对于T细胞，用另一种细胞代替T细胞（功能失活实验）导致邻域衰老减少（图4e），而用任何一种细胞替换为T细胞（功能激活实验）则增加了邻域衰老（图4f）；而对于NSC，功能失活增加了邻域衰老（图4e），功能激活则减少了邻域衰老（图4f）。

此外，替代或添加中性细胞类型（如内皮细胞）不会显著影响邻域衰老（图4e,f），进一步证实了T细胞对其邻居有促进衰老的作用，而NSC对其邻居有促进年轻化的作用。

研究人员对超过12,000个基因进行了非偏倚差异表达分析，揭示了T细胞附近的细胞表现出与病毒免疫反应相关的基因增加表达（图5a）。这种现象可能是在干扰素信号作用下的响应。具体来说，具有更大促衰老效应的T细胞显示出更高的“促进型II型干扰素产生”的假定基因表达水平（图5b），这与IFNγ通路在效应性T细胞中的增加一致。相应地，在T细胞附近的靶细胞也显示出IFNγ应答基因的同步上调。匹配细胞类型和亚区域后，靠近T细胞的靶细胞表现出“细胞对II型干扰素反应”的假定基因增加表达（图5c）。

为了验证这些发现，研究人员使用抗CD3（T细胞标记物）和STAT1（干扰素反应标记物）抗体对28个月龄小鼠脑冠状切片进行了免疫荧光染色。结果显示，靠近T细胞（CD3+）的细胞中STAT1强度显著高于远离T细胞的细胞，在胼胝体（CC）、皮层（CTX）和腹侧脑室区（VEN）中均呈统计学意义差异，而在纹状体（STR）中呈趋势性增加（图5d-e）。这些结果通过实验验证了T细胞临近效应与附近细胞上调的干扰素响应相关，并提出了IFN信号可能介导T细胞促衰老效应的可能性。

非偏倚差异表达分析还揭示了NSC附近的细胞中上调了与内吞途径和脂质代谢相关的基因（图5f）。进一步研究显示，具有更强促再生效应的NSC表现出“胞吐”和“外泌体分泌”的假定基因表达增加，以及外泌体标志物Cd9的增加，并且与Vegfa的增加趋势一致，这是MERFISH中唯一由NSC分泌的生长因子的基因（图5g）。外泌体参与神经发生，可能介导NSC对其邻近细胞的再生促进效果。Vegfa则有助于维持神经干细胞群落细胞的存活并延长宿主寿命。同时，靠近NSC的细胞表现出与细胞摄入和内吞作用相关的假定基因上调，多种生长因子的细胞响应增强，并且“NADH生理学过程”增加，该过程与脂肪酸氧化代谢有关，关联到更年轻的脑状态（图5h）。

为了验证NSC的再生促进效应，研究人员使用抗神经干细胞标记物S100A6、外泌体标记物CD9以及脂肪酸氧化标记物CPT1A对3.5个月大雄性小鼠脑组织切片进行免疫荧光染色。在年轻小鼠的腹侧脑室区（VEN），神经干细胞（S100A6+）显著高于其他细胞类型（non-NSC）。值得注意的是，在VEN中靠近神经干细胞的细胞，其CPT1A强度明显高于远离神经干细胞的细胞（图5i-j-l）。此外，神经干细胞的CD9强度和附近细胞的CPT1A强度呈正相关（图5m）。这些实验结果支持了神经干细胞中外泌体标记物强度增加与其附近细胞中脂质氧化增强之间的关联，并提出这些变化可能部分介导了神经干细胞的促再生临近效应。

拓展延伸

空间转录组学在其他科研领域的应用：

1. 肿瘤生物学

空间转录组学为肿瘤研究带来了全新的视角。传统上，科学家们主要依赖于组织病理学染色和单细胞RNA测序来分析肿瘤微环境。然而，这些方法往往无法精确描绘出癌细胞与其周围基质、免疫细胞之间的复杂互动关系。通过空间转录组学，研究人员可以直观地看到不同类型的细胞在肿瘤内的分布情况及其基因表达特征，从而更好地理解肿瘤异质性和进化动态。例如，在乳腺癌的研究中，科学家们利用该技术揭示了肿瘤边缘区域存在一个由成纤维细胞、巨噬细胞及T细胞组成的独特生态位，这可能是导致化疗耐药性的原因之一。此外，对于转移灶的研究也表明，原发灶与转移灶之间存在着显著的空间转录差异，提示着不同的治疗策略可能需要针对特定部位进行优化。

2. 发育生物学

在胚胎发育过程中，细胞的空间排列和相互作用决定了器官形成的关键步骤。以往的研究大多基于形态学观察或基因敲除实验，难以捕捉到实时变化的信息。现在，借助空间转录组学，我们可以追踪特定细胞群体在整个发育过程中的迁移路径及其分子调控网络。比如，在心脏发育领域，有研究发现心外膜下的祖细胞会沿着特定方向迁移到心肌层，并在此过程中激活一系列特异性基因表达，最终分化为血管平滑肌细胞。这项发现不仅增进了我们对心血管系统起源的理解，也为再生医学提供了新的思路。类似地，在神经管闭合期间，背侧和腹侧神经元前体细胞展现出截然不同的基因表达谱，暗示着它们未来功能上的分工早已注定。

3. 免疫学

免疫反应通常涉及多种细胞类型之间的协作，包括抗原呈递细胞、T/B淋巴细胞以及自然杀伤细胞等。为了探究这些细胞如何协调工作以抵御病原体入侵，研究人员开始采用空间转录组学来剖析局部免疫环境。一项关于流感病毒感染后肺部免疫应答的研究显示，感染初期，树突状细胞聚集于支气管旁淋巴结附近，随后招募并激活大量的CD8+ T细胞；而在恢复阶段，则是由调节性T细胞主导，维持组织稳态。此外，该技术也被应用于自身免疫性疾病如类风湿关节炎的研究中，发现了滑膜组织内存在一个由活化的B细胞和浆细胞构成的核心结构，它们持续分泌致炎因子，加剧炎症反应。此类发现有助于开发更精准的靶向疗法，改善患者预后。

4. 植物科学

尽管上述例子大多集中在动物模型上，但空间转录组学同样适用于植物科学研究。植物体内的细胞具有固定的相对位置，因此非常适合用此技术研究其内部结构和功能分区。例如，在根尖分生组织中，通过高分辨率成像可以清楚地看见各个细胞层（表皮、皮层、维管束）的基因表达模式，进而推断出它们各自承担的角色。另外，在叶片光合作用过程中，叶绿体周围的细胞表现出特有的基因表达谱，反映了光能吸收与转化所需的酶系组成。这类研究不仅能加深我们对植物生长发育规律的认识，还可能为农业生产提供技术支持，比如培育更加耐旱或高效固氮的新品种。

临床应用与展望

带有时间序列的空间转录组学研究不仅加深了我们对脑老化生物学过程的认识，也为寻找延缓甚至逆转衰老的有效方法提供了宝贵的线索。随着后续工作的推进，相信会有越来越多令人振奋的结果涌现出来，最终造福全人类。

注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。

参考文献

Sun ED, Zhou OY, Hauptschein M, Rappoport N, Xu L, Navarro Negredo P, Liu L, Rando TA, Zou J, Brunet A. Spatial transcriptomic clocks reveal cell proximity effects in brain ageing. Nature. 2024 Dec 18.

来源：新浪财经