摘要：热蛋白质组学（Thermal Proteomic Profiling, TPP）是一种结合热稳定性分析与质谱技术的高通量、无偏向性蛋白质组筛选方法。其原理是yao物与蛋白结合会影响蛋白质的热稳定性，使结合蛋白在加热后表现出更高的稳定性。蛋白质的热稳定性变化是研
热蛋白质组学（Thermal Proteomic Profiling, TPP）是一种结合热稳定性分析与质谱技术的高通量、无偏向性蛋白质组筛选方法。其原理是yao物与蛋白结合会影响蛋白质的热稳定性，使结合蛋白在加热后表现出更高的稳定性。蛋白质的热稳定性变化是研究配体结合的重要手段，也是yao靶发现的关键环节。当细胞或细胞裂解液被加热到特定温度时，蛋白质会发生变性并逐渐不溶。然而，与非结合状态的蛋白相比，被小分子yao物结合的蛋白更具热稳定性，在相同温度条件下其变性程度较小。通过比较不同温度下蛋白质的溶解曲线（Tm）及其差异（ΔTm），TPP能够在全蛋白质组水平上识别潜在的yao物靶点，并通过通路富集分析和实验验证锁定关键靶点。目前，热蛋白质组学已广泛应用于新yao靶点发现、机制解析和yao物适应症拓展等领域，尤其在揭示小分子yao物的多靶点效应方面具有显著优势。
细胞热转移实验（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA） 是一种经典的热稳定性分析方法，它通过检测蛋白在不同温度条件下的热稳定性，来揭示小分子yao物与蛋白质的结合情况。CETSA最初多采用蛋白质印迹法（WB）进行检测，这种方法虽然特异性较高，但通量较低，通常适用于靶点筛选后的验证阶段。随着质谱技术的飞速发展，CETSA与基于质谱的定量蛋白质组学相结合，衍生出了热蛋白质组学（TPP） 方法。这种结合定量质谱和热稳定性分析的技术，为yao物靶点的全面解析提供了强有力的支持，显著提高了yao物靶标筛选的效率和准确性。在小分子yao靶研究日益复杂的今天，我们凭借深厚的蛋白质组学研究积淀和先进的质谱平台，为科研人员提供高效、精准的热蛋白质组学（TPP）解决方案，助力新yao研发及yao物靶点的全面解析。
图1. TPP方法流程（Savitski et al., 2014）
相关应用文献一：
乳酸通过重塑细胞分裂后期促进复合体来调节细胞周期
期刊：Nature
IF：50.5
时间：2023
主要研究内容：
乳酸在快速分裂的细胞中是丰富的，因为需要提高葡萄糖分解代谢来支持增殖，但是目前尚不清楚积累的乳酸是否影响增殖状态。在这里使用系统的方法来确定横跨人类蛋白质组的蛋白质的乳酸依赖调节。为了确定乳酸丰度升高对整个蛋白质组的直接影响，研究人员应用TPP方法系统地评估蛋白质热稳定性的变化，监测了超过3900个蛋白质的乳酸依赖性热稳定性变化，其中表现出最稳定的热稳定性变化的蛋白是UBE2C。后续的研究确定了一种细胞周期调节机制，即积累的乳酸重塑了后期促进复合物（APC/C），以这种方式重塑APC/C是由乳酸直接抑制SUMO蛋白酶SENP1引起的。研究发现积累的乳酸通过在SENP1活性位点与锌形成复合物结合并抑制SENP1。乳酸抑制SENP1稳定了APC4上两个残基的SUMOylation，从而驱动UBE2C与APC/C结合。乳酸对APC/C的直接调节刺激细胞周期蛋白的定时降解，并在增殖的人类细胞中有效地退出有丝分裂。这个机制是在有丝分裂进入时乳酸丰度达到顶点时启动的。通过这种方式，乳酸的积累传达了营养充足的生长阶段的结果，以刺激APC/C的定时开放、细胞分裂和增殖。相反，乳酸的持续积累会导致APC/C异常重构，并通过有丝分裂滑移克服抗有丝分裂yao理学。
图2. 乳酸调节APC/C蛋白相互作用
相关应用文献二：
选择性激活PFKL可抑制吞噬性氧化爆发
期刊：Cell
IF：45.5
时间：2021
研究概要：
图3
主要研究内容：
在中性粒细胞中，通过戊糖磷酸途径产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）为NADPH氧化酶NOX2提供燃料，产生活性氧来杀死入侵的bing原体；但是过量的NOX2活性可加重炎症，如急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。在这里使用两种无偏向的化学蛋白质组学（TPP+PISA）策略来证明小分子LDC7559或更有效的设计类似物NA-11，通过激活糖酵解酶磷酸果糖激酶-1肝型（PFKL）和抑制戊糖磷酸途径的通量来抑制中性粒细胞中NOX2依赖性的氧化爆发。因此，用NA-11处理的中性粒细胞减少了NOX2依赖性输出，包括中性粒细胞死亡（NETosis）和组织损伤。PFKL的高分辨率结构证实了NA-11与AMP/ADP变构活化位点的结合，并解释了为什么NA-11不能诱导磷酸果糖激酶-1血小板型（PFKP）或肌肉型（PFKM）。因此，NA-11代表了一种选择性激活PFKL的工具，PFKL是免疫细胞中表达的主要磷酸果糖激酶-1亚型。
图4. NA-11全局相互作用物和特异性靶点的化学蛋白质组学分析
相关应用文献三：
热蛋白质组分析显示果糖-1,6-二磷酸是激活磷酸甘油突变酶1的磷酸供体
期刊：Nature Communications
IF：14.7
时间：2024
主要研究内容：
对糖代谢-蛋白质相互作用的深入理解将为糖代谢重编程在人体生理bing理中的应用提供启示。尽管已经为确定单个事件做出了巨大的努力，但对这种相互作用的全局分析仍然具有挑战性。此项研究通过糖酵解代谢产物果糖-1,6-二磷酸（FBP）相互作用蛋白的热蛋白质组学分析，揭示了FBP的化学信号作用，它作为磷酸供体激活磷酸甘油酸突变酶1 (PGAM1)，并为糖酵解和细胞增殖提供通路内反馈。在分子水平上，FBP向PGAM1的催化组氨酸提供C1-O-磷酸或C6-O-磷酸，形成3-磷酸组氨酸（3-pHis）修饰。重要的是，结构-活性关系研究有助于发现可能抑制ai细胞增殖的PGAM1直立抑制剂。研究共同描绘了FBP相互作用组的光谱，并发现了FBP独特的共价信号功能，该功能通过组氨酸磷酸化支持Warburg效应，从而激发了针对糖代谢的yao理学工具的开发。
图5. FBP相互作用蛋白的热蛋白质组分析（TPP）
随着热蛋白质组学（TPP）在小分子yao靶研究中的广泛应用，科研人员在靶点筛选、yao物重定位及新yao开发等领域的研究进入了全新的阶段。通过高通量、高灵敏度的蛋白质组学分析，TPP能够高效识别潜在的yao物靶点，并为yao物机制的深入理解提供强有力的数据支持。
参考文献：
1.Mikhail M. Savitski et al. ,Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.Science346,1255784(2014).DOI:10.1126/science.1255784.
2.Liu, W., Wang, Y., Bozi, L.H.M. et al. Lactate regulates cell cycle by remodelling the anaphase promoting complex. Nature 616, 790–797 (2023). http://doi.org/10.1038/s41586-023-05939-3.
3.Amara, Neri et al. Selective activation of PFKL suppresses the phagocytic oxidative burst. Cell, Volume 184, Issue 17, 4480 - 4494.e15.
4.Zhang, Y., Cao, Y., Wu, X. et al. Thermal proteome profiling reveals fructose-1,6-bisphosphate as a phosphate donor to activate phosphoglycerate mutase 1. Nat Commun 15, 8936 (2024). http://doi.org/10.1038/s41467-024-53238-w.
来源：小陈的科学讲堂