“现货版”组织工程基于支架干细胞冻存，伤口修复即取即用

摘要：干细胞的高效低温保存对于制造现成的细胞产品用于组织工程和再生医学至关重要。然而，由于在冻融循环中使用有毒的冷冻保护剂来减少与冰相关的干细胞的冷冻损伤、严格的解冻后洗涤过程以及将干细胞与支架进一步整合以形成下游应用的组织工程构建物，因此干细胞的低温保存仍然面临巨

仅供医学专业人士阅读参考

准时接收每日精彩内容推送。

干细胞的高效低温保存对于制造现成的细胞产品用于组织工程和再生医学至关重要。然而，由于在冻融循环中使用有毒的冷冻保护剂来减少与冰相关的干细胞的冷冻损伤、严格的解冻后洗涤过程以及将干细胞与支架进一步整合以形成下游应用的组织工程构建物，因此干细胞的低温保存仍然面临巨大的挑战。

鉴于此，郑州大学的睢晓洁团队开发了一种基于抗冷冻聚乙烯吡咯烷酮/结冷胶/明胶（PGG）支架的新型干细胞冻存平台与 L-脯氨酸辅助细胞预脱水策略。相关成果以“An Antifreezing Scaﬀold-Based Cryopreservation Platform of Stem Cells for Convenient Application in Wound Repair”为题于2024年12月26日发表在《Advanced Healthcare Materials》上。

在这项工作中，作者旨在建立一种新型的基于3D支架的干细胞冷冻保存平台，使其能够在组织工程中方便应用。因此，作者开发了一种具有良好抗冻性能的生物相容性聚乙烯吡咯烷酮/结冷胶/明胶(PGG)支架，同时结合L-脯氨酸（L-Pro）整合生物启发的预脱水策略，减少细胞外/细胞内冰相关的冷冻损伤，实现干细胞的高效冷冻保存。由于在整个冷冻保存过程中消除了DMSO等任何传统的有毒冷冻保护剂，因此解冻后的装载干细胞的PGG支架可以直接用于伤口修复，而无需任何洗涤过程。

1. 抗冻PGG支架的制备

在低温保存过程中，冰晶的形成和生长对细胞是有害的。基于低温保存过程中与冰相关的低温损伤机制，作者使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、结冷胶和明胶设计了具有互穿网络的抗冻PGG支架（图1A）。通过FTIR光谱显示了PVP、结冷胶和明胶的特征峰，表明PGG支架形成（图1B）。扫描电镜结果表明，该支架具有均匀的孔径，有利于细胞渗透和营养物质的运输。冻干后的支架在细胞培养基中5min内即可实现肿胀平衡，具有进一步包埋细胞的良好能力（图1C）。此外，PGG支架在体外和体内均表现出良好的生物降解性（图1D）。以上结果证明了PGG支架的成功制备及其良好的细胞结合物理性能，为进一步应用提供了基础。

图1 PGG支架的制备与表征

2.抗冻PGG支架的表征

接下来，作者分别从热、动力和结构三个方面对PGG支架的抗冻性能进行表征。差示扫描量热法（DSC）结果显示，由于解冻过程中冰融化，所有样品都显示出热峰（图2A）。与对照组或PVP组相比，PGG支架的冰点和可冻水含量明显降低，表明其具有抑制冰形成的能力（图2B-C）。以PGG4:1支架为例，通过低场核磁共振（LF-NMR）分析进一步表征了支架内部的水迁移率。与对照组和PVP组相比，PGG4:1支架的T2随结合水含量的增加而降低，与DSC结果一致（图2D-E）。水分子间氢键排列不那么有序，表明成冰能力下降。拉曼光谱结果证实了PGG4:1支架具有较强的抑冰能力（图2F-G）。作者通过密度泛函理论计算从分子水平上了解了PGG4:1支架中各组分与水的相互作用。结果表明PGG4:1支架中的每个组分都与水分子具有更强的相互作用，使其能够破坏水分子的氢键网络，从而抑制冰的形成（图2H）。综上证明了PGG4:1支架具有优异的抗冻能力，有利于在冷冻保存过程中抑制冰相关对细胞的冷冻损伤。

图2 支架的防冻性能表征

3.L-Pro辅助骨髓间充质干细胞的预脱水

在冷却前对细胞进行预脱水是通过降低含水量来减少细胞内冰相关冷冻损伤的有效策略。在这项工作中，L-Pro是一种积累在耐寒生物中的生物相容性氨基酸，被选择用于处理骨髓间充质干细胞（BMSCs）预脱水(图3A)。研究表明L-Pro培养的BMSCs直径比未处理的新鲜干细胞小，说明L-Pro可以促进骨髓间充质干细胞脱水（图3B-C）。在低温保存过程中，水的冻结会导致细胞的高渗环境。有趣的是，L-Pro可以作为一种渗透调节剂来减轻BMSCs的渗透压。当BMSCs暴露在含有1% NaCl的高渗培养基中时，由于NaCl诱导的渗透休克，粘附细胞形态异常，活力降低（图3D-G）。在1% NaCl溶液中添加4% L-Pro可维持细胞正常的附着能力和成活率。这是因为L-Pro可以通过转运蛋白进入高渗状态下的细胞中，从而调节渗透压，减少对细胞的渗透性损伤。以上结果表明，L-Pro可以促进骨髓间充质干细胞脱水，减轻渗透休克对细胞的渗透损伤，在低温保存过程中具有取代DMSO的细胞内保护作用。

图3 L-Pro辅助骨髓间充质干细胞预脱水

4.基于PGG支架的骨髓间充质干细胞冷冻保存平台的构建

在这项工作中，作者旨在开发一种基于3D支架的冷冻保存平台，不仅能够实现高度的冷冻保护效果，而且可以消除DMSO的使用，从而促进直接组织工程应用（图4A）。为此，作者首先研究了负载和释放BMSCs的可行性。结果表明BMSCs能够容易地负载到PGG支架中，并且分布均匀(图4D)。在加入EDTA溶液后，能够螯合结合链关联所需的Ca2+，从而溶解PGG支架的3D网络，负载的BMSCs可以在1分钟内从PGG支架上释放出来(图4B)。此外，负载和释放过程对细胞活力的影响可以忽略不计(图4C)。考虑到PVP的细胞毒性作用，在制备PGG支架时作者选择了5%的PVP浓度。为了增加冷冻细胞的存活率，采用L-Pro辅助的预脱水策略来提供细胞内保护。在冷冻前用4%的L-Pro预脱水1小时，经5% PVP冷冻保存的BMSCs存活率为86.83%（图4E）。结果显示采用优化的L-Pro辅助预脱水策略(以4%的L-Pro孵育1小时)，PGG支架冷冻保存的骨髓间充质干细胞的存活率高达约95%，显示出协同冷冻保护作用（图4F-G）。由于不同比例的结冷胶和明胶的PGG支架具有相似的冷冻保护效果，因此作者随机选择PGG4:1支架，结合预脱水策略建立冷冻保存平台，用于后续实验（图4H）。冷冻保存后，解冻后的细胞会发生延迟性细胞死亡，因此解冻后的即时活力可能导致冷冻保存效果的假阳性结果。因此，作者进一步评估了解冻后不同时间点的细胞活力。解冻后24 h内，细胞活力略有下降；解冻后48 h，由于骨髓间充质干细胞的恢复，其活力进一步上升，与传统的冷冻保存方法相当（图4I）。值得注意的是，这种低温保存平台可以在4个月的长期保存期间提供稳定的冷冻保护效果（图4J）。此外，该冷冻保存平台还可用于大鼠骨髓间充质干细胞（图4K）。以上结果证实在L-Pro辅助预脱水策略下，PGG支架可以作为骨髓间充质干细胞的高效、多功能冷冻保存平台。

图4 低温保存测试

5. 基于PGG支架的低温保存平台的生物相容性

作者进一步对冷冻保存平台的生物相容性进行了评估。结果显示L-Pro组、PVP组和PGG4:1组的细胞活力与对照组相近，表明所选择的材料构建低温保存平台具有良好的细胞相容性（图5A）。此外，溶血实验结果显示L-Pro组、PVP组和PGG4:1组的溶血率均明显低于临床应用所需的5%的临界值，说明它们具有良好的血液相容性（图5B）。对于组织工程应用而言，植入材料的组织相容性至关重要。作者使用皮下埋植方法评估支架的组织相容性。与未处理的对照组相比，植入PGG4:1支架的小鼠3天和7天的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)、肌肉和周围皮肤组织均未见明显异常变化（图5C），表明PGG4:1支架没有引起急性或慢性炎症反应。综合以上结果，L-Pro和PGG4:1支架低温保存平台具有良好的生物相容性。它可以减少传统冷冻保存方法所需的逐步和耗时的洗涤过程的问题，也有利于直接使用冷冻保存BMSCs@PGG4:1用于组织工程。

图5 生物相容性测试

6. 冷冻保存的BMSCs@PGG体外功能评估

由于冷冻保存平台具有良好的生物相容性，作者将解冻后的BMSCs@PGG4:1直接培养，不经过任何洗涤过程进行增殖试验。与新鲜BMSCs、BMSCs@PGG4:1相比，冷冻保存BMSCs@PGG4:1的促增殖率略有降低(图6A)。这可能是由于BMSCs在低温保存后延迟了原位细胞死亡，导致可增殖的活细胞减少。其次，作者评价了反映BMSCs干性的多系分化能力。油红O和甲苯胺蓝染色结果表明BMSCs在冷冻保存后仍能保持良好的成脂和成骨分化潜力（图6B）。作者进一步收集新鲜和低温保存组BMSCs的条件培养基(CMs)，并与参与皮肤伤口愈合的细胞共培养，以研究其旁分泌能力（图6C）。与对照组相比，新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1的CMs处理细胞的增殖率相似，表明冷冻保存BMSCs@PGG4:1可以保持旁分泌能力，促进纤维末梢增殖（图6D）。随后，通过划痕实验评估不同组旁分泌产物的作用。与空白对照组相比，新鲜或低温保存BMSCs@PGG4:1的CMs显著促进了细胞的迁移。值得注意的是，与新鲜BMSCs组相比，新鲜或低温保存BMSCs@PGG4:1组对细胞的促迁移作用增强，这可能是由于PGG支架的细胞外基质模拟特性使BMSCs具有更好的旁分泌能力。综上所述，低温保存BMSCs@PGG4:1在低温保存后仍能保持其旁分泌功能，这对其在组织工程中的应用至关重要。

图6 功能评估测试

7. 冷冻保存BMSCs@PGG作为伤口修复的组织工程构建物

基于低温保存平台良好的生物相容性和体外维持良好的干细胞解冻后功能，作者建立了伤口模型，以评估低温保存BMSCs@PGG4:1作为组织工程构建物在体内的治疗效果。结果表明新鲜和冷冻保存的BMSCs@PGG4:1组都比新鲜的BMSCs组显示出更快的伤口愈合速度，可能是因为PGG4:1支架可以为干细胞提供3D基质环境，以支持它们在受伤部位的存活和持久性（图7A-C）。H&E染色图像显示，相比对照组和新鲜BMSCs组，新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1组显示炎症细胞浸润减少，成纤维细胞增加，并伴有伤口区域新血管结构的形成(图7D)。值得注意的是，新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1组的表皮厚度明显比其他组薄(图7F)。肉芽组织厚度评估显示，对照组和新鲜BMSCs组肉芽组织明显比新鲜和低温保存BMSCs@PGG4:1组厚(图7G)，这一发现表明新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1组的肉芽组织已进入成熟阶段。研究人员进一步分析了瘢痕指数，新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1组显示出完整的真皮，厚度与未受伤的皮肤一致，这表明这些组的伤口可能已经达到了愈合的最后阶段(图7H)。Masson染色显示，与对照组和新鲜BMSCs相比，用新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1处理的伤口显示出更多的胶原沉积(图7E-I)。

图7 伤口修复的体内治疗效果

免疫荧光染色分析进一步证实在伤口修复的第14天，与对照组和新鲜BMSCs组相比，新鲜和冷冻保存BMSCs@PGG4:1组均表现出促炎因子的表达减少，抗炎因子的表达增加。同时，在冷冻保存BMSCs@PGG4:1组中α-SMA和CD31的表达与新鲜BMSCs@PGG4:1组相似，高于新鲜BMSCs组和对照组，表明低温保存不影响其促进病变血管生成的性能(图8)。综上所述，冷冻保存BMSCs@PGG4:1可以作为组织工程构建物，能够促进小鼠全层皮肤缺损修复，而不会影响其治疗效果。

图8 伤口修复第14天组织免疫荧光染色

8. 冷冻保护机制

基于PGG支架的抗冻低温保存平台结合预脱水策略，高细胞存活率和方便皮肤再生应用的机制如图9所示。i)将BMSCs直接包封在抗冻PGG支架中进行冷冻保存时，PGG支架作为大分子冷冻保护剂可以在冷冻和解冻过程中最大限度地减少细胞外冰晶，但由于细胞内成冰，结果仍然不理想；ii)当骨髓间充质干细胞在冷冻前用L-Pro预脱水，并在不添加任何冷冻保护剂的情况下冷冻保存时，由于预脱水策略减少了水分含量，细胞内冰的形成受到抑制。然而，由于缺乏添加冷冻保护剂的细胞外保护，骨髓间充质干细胞会遭受细胞外冰相关损伤，最终在解冻后死亡；iii)骨髓间充质干细胞在冷却前经L-Pro适度预脱水，再包封在防冻PGG支架中冷冻保存，可实现细胞外和细胞内的冰抑制，从而提高细胞存活率。同时，由于在整个过程中避免了有毒的冷冻保护剂，因此可以省去解冻后严格的洗涤程序。因此，将解冻后的骨髓间充质干细胞包裹在PGG支架中，可以作为一种组织工程构建体，方便地应用于皮肤再生。