摘要：2023年10月16日，荷兰研究学者在期刊Stem Cells Translational Medicine（IF:5.9998）发表了一篇题为“T-Cell Mediated Immune Rejection of Beta-2-Microglobulin
文章介绍
2023年10月16日，荷兰研究学者在期刊Stem Cells Translational Medicine（IF:5.9998）发表了一篇题为“T-Cell Mediated Immune Rejection of Beta-2-Microglobulin Knockout Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Kidney Organoids”的文章。
#1
摘要
Abstract
具有免疫回避性的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肾脏类器官被称为 "隐形 "类器官，有望用于临床移植。为了解决免疫排斥问题，我们研究了移植前对肾脏类器官中人类白细胞抗原（HLA）I类进行基因修饰的影响。通过使用CRISPR-Cas9，成功地敲除了β-2-微球蛋白（B2M），从而产生了没有HLA I类表面表达的iPSCs。通过研究得出结论，仅敲除 B2M 不足以保护 iPSC 衍生的肾脏类器官免受 T 细胞介导的免疫排斥。此外，我们的研究结果表明，要防止移植后的排斥反应，必须调节 HLA II 类信号传导。
图文摘要
#2
研究思路
Methods
本文的研究旨在探讨使用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肾脏类器官进行移植时，T细胞介导的免疫排斥反应的挑战和解决策略。研究方法主要包括：
1.RNA测序和实时荧光定量PCR：使用纳米滴定法测量RNA浓度，将SuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）产生的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR），使用SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在CFX Connect实时系统（Bio-Rad）中进行。基因表达被标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的水平，并根据比较Ct方法（2-ΔΔCt）相对于相应对照组确定相对mRNA水平。
2. RNA质量评估：将所有三个分化阶段的RNA样本发送到GenomeScan B.V.进行批量RNA测序之前，使用Experion进行RNA质量评估。
#3
主要结果
Results
生成 B2M-/- iPSC 及其衍生的肾脏类器官
通过CRISPR-Cas9介导同源重组，在B2M基因的外显子1中引入GFP/PGK-puromycin含量的嵌合体，从而生成B2M–/– iPSCs。这些iPSCs可以分化为肾脏类器官，这些类器官表达HLA I，而且在炎症细胞因子IFN-γ的刺激下，其HLA I表达会增加，使它们容易受到T细胞介导的免疫排斥反应的攻击。因此，通过B2M基因的敲除，可以减少HLA I的表达，从而减少移植后的免疫排斥反应。
图1 对 iPSCs 的 B2M 基因座进行基因修饰。(A) 通过 CRISPR-Cas9 和基因组 PCR 验证正确插入的 B2M 基因座基因修饰策略示意图。使用了两个引物对，分别跨越插入物两端的同源臂，产生大小为 1710 和 1244 bp 的 PCR 产物。未修饰的对照 iPSC 用作阴性对照（Control-），3 个 B2M-/- 克隆（2 号、7 号和 10 号）的 PCR 结果如图所示。(B) 通过 RT-qPCR 测定对照 iPSCs 和 B2M-/- 克隆在未刺激和 IFN-γ 刺激条件下的 B2M mRNA 表达（n = 3 个独立实验）。(C) 通过流式细胞术测量 HLA-ABC 表面表达。未染色的对照 iPSCs 用作阴性对照，所有细胞系均在未刺激和 IFN-γ 刺激条件下进行测量（n = 3 个独立实验）。
图2 经修饰的 iPSCs 的肾脏类器官分化。(iPSCs 在第 0 天（d0）播种，在第 7 天（d7）收获，并作为细胞团块在过滤器顶部培养至第 7 + 20 天（d7 + 20）。培养基中添加生长因子的变化在时间轴中标出。(B) 对照组和 B2M-/- 克隆在 3 个时间点的大量 RNA 测序数据 PCA 图：未分化 iPSCs（第 0 天）、中间中胚层细胞（第 7 天）和分化末期（第 7 + 20 天）的肾类器官。详细分析见补充图 S3。(C) 整个类器官的代表性荧光图像，上图为类器官的四分之一，下图为类器官内的高倍放大图。通过 NPHS1（肾小球）、LTL（近端肾小管）和 ECAD（远端肾小管）检测肾小球的特定单位。细胞核用 Hoechst 染色。
B2M-/- 可防止 CD8+ T 细胞与体外肾脏类器官发生反应
通过将HLA-A*02:01特异性的细胞毒性T细胞或CMV特异性的细胞毒性T细胞与控制组和B2M–/–类器官共培养2天，来评估控制组和B2M–/–类器官的免疫原性。通过流式细胞术分析和ELISA检测，发现在HLA-A*02:01特异性的细胞毒性T细胞的刺激下，控制组的类器官表达了HLA I和CD54（ICAM），而B2M–/–类器官则没有表达。这表明，B2M基因的敲除可以防止CD8+ T细胞对肾脏类器官的免疫反应，从而减少移植后的免疫排斥反应。
图3 与 T 细胞的体外肾脏类器官共培养试验。(A) 体外共培养实验示意图和读数。(B-C）通过流式细胞术测量的类器官细胞（B）HLA-ABC 和（C）CD54（ICAM）的表面表达。未加入 T 细胞（未受刺激）培养的肾脏类器官细胞作为对照，设为 1 进行比较。结果显示的是用IFN-γ、CMV反应性T细胞（CMV）或HLA-A2反应性T细胞（Allo-A2）培养的肾脏类器官细胞（IFN-γ为n = 2个独立实验，其他为n = 3）。(D) 用流式细胞术测量与对照组或 B2M-/- 肾脏类器官一起培养的 CD8+ T 细胞的 CD137 表达。单独培养（未受刺激）的 T 细胞作为对照，并设置为 1 以进行比较（n = 3 个独立实验）。(E) 用 ELISA 测定对照组或 B2M-/- 肾脏类器官培养的 T 细胞上清液中 IFN-γ 的分泌量。单独培养的 T 细胞（未受刺激）作为自发 IFN-γ 分泌的对照（n = 3 个独立实验）。B2M-/-类器官克隆分别用2号（圆形）、7号（三角形）和10号（星形）符号表示。
B2M-/- 不能防止体内T细胞介导的移植肾脏类器官的免疫排斥反应
通过将控制组和B2M–/–类器官分别移植到小鼠体内，来评估B2M基因的敲除是否可以防止移植后的免疫排斥反应。结果显示，CD4+ / CD8+ T细胞的免疫细胞浸润、CD3+ KI-67+比例和CD8+ GrB+比例在控制组和B2M–/–类器官之间没有差异。这表明，B2M基因的敲除并不足以防止T细胞介导的免疫排斥反应，即使控制组的类器官也会引起次级免疫反应，导致B2M–/–类器官的免疫排斥反应。
图4 研究体内 T 细胞介导的肾脏类器官免疫排斥反应的人源化小鼠模型。(A) 体内实验装置示意图。对照组和 B2M-/- 器官成对移植到 16 只小鼠体内。移植一周后，4 只小鼠注射 PBS，12 只小鼠注射 3 个不同供体的 PBMC（每个 PBMC 供体 4 只小鼠）。(B-C）用流式细胞术测量小鼠外周血中人类 CD45+ 细胞占白细胞总数的比例。(B）结果显示的是移植后第 14 天和第 35 天的结果，每只小鼠的结果相连（n = 16）。(C）第 35 天的结果按组分别显示。注射 PBS（阴性对照）的小鼠显示为黑色（n = 4 只注射 PBS 的小鼠）。注射 3 种不同供体的人 PBMC 的小鼠（每种供体 4 只小鼠）用不同颜色表示（n = 12 只注射 PBMC 的小鼠）。(D) 通过流式细胞术测量用于注射的原始 PBMC 储存库（阳性对照）中的 hCD45+ 细胞亚群和第 35 天时在小鼠外周血中循环的 hCD45+ 细胞亚群。测量的亚群包括 T 辅助细胞（CD4）、细胞毒性 T 细胞（CD8）、单核细胞/巨噬细胞（CD14）、B 细胞（CD19）和 NK 细胞（CD56）。显示的是 2 个供体（PBMC 供体 2 和 3）的 PBMC 储存结果，显示的是每个 PBMC 供体的小鼠外周血结果（n = 每个供体 4 只小鼠）。(E和F）通过流式细胞术测量移植后第35天hCD45 +群体中（E）T辅助细胞（CD3+CD4+）和（F）细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）的比例。
图5 对照组和B2M-/-肾脏类器官中T细胞介导的免疫排斥反应。(A）小鼠肾脏上移植的肾脏类器官的图像，用 CD3（NovaRED）染色以检测 T 细胞。图中显示了对照组和 B2M-/- 组的代表性类器官。左图为肾脏顶部类器官的切面概览。中图和右图分别是类器官与小鼠肾脏边界和类器官中心的放大图。T细胞浸润肾小管壁（肾小管炎）的位置用*标出。(B) 移植到同一只小鼠体内的对照组和 B2M-/- 肾脏类器官的代表性荧光图像。每张图片都显示了用白色方框表示的区域的放大图，包括不同的荧光通道（CD4、CD8、Hoechst）。(C-F）用 Qupath 分析的类器官切片中（C）CD4+细胞占细胞总数的比例、（D）CD8+细胞占细胞总数的比例、（E）CD3+细胞中的 Ki-67+ 细胞、（F）CD8+细胞中的颗粒酶 B (GrB)+ 细胞。
B2M-/- 和对照组肾脏类器官中的 HLA II 类上调
通过对移植的肾脏类器官进行HLA class II（HLA-DR/DP/DQ）染色，来评估B2M基因的敲除是否会影响HLA class II的表达。结果显示，在未注射人类PBMCs的小鼠体内移植的类器官中，肾小管结构的染色较浅，表明肾小管上皮细胞中HLA class II的表达较低。但在注射了人类PBMCs的小鼠体内移植的类器官中，免疫细胞和肾脏类器官中的HLA class II表达均较高，尤其是肾小管结构的上皮细胞中的HLA class II表达也较高。这表明，B2M基因的敲除并不能防止HLA class II的表达，而HLA class II的表达也会增加肾脏类器官的免疫原性，从而增加移植后的免疫排斥反应的风险。因此，调节HLA class II信号可能是防止移植后免疫排斥反应的必要手段。
图6 移植肾类器官中的 HLA II 类表达。(A) 移植肾脏类器官切片经 HLA-DR/DP/DQ 染色后的代表性图像，左侧为类器官概览，右侧为肾小球结构放大图。上图为移植到 PBS 注射小鼠体内的对照类器官。中图和下图显示的是移植到同一只注射了 PBMC 的小鼠体内的对照组和 B2M-/- 器官。 (B) 点阵图显示了未移植的肾脏类器官和移植到鸡胚中 8 天的肾脏类器官的 scRNA 测序数据集中 HLA-DRB1、HLA-DPB1 和 HLA-DQB1 的 mRNA 比例表达水平。标注了内皮细胞（EC）、荚膜细胞、近端肾小管细胞、Henle 环样细胞和远端肾小管/集合管细胞的比例表达水平。点的颜色和大小分别表示所示基因的比例表达水平和表达该基因的细胞百分比。
总结
本文的研究结果表明，B2M基因的敲除并不能完全防止移植后的免疫排斥反应，即使控制组的类器官也会引起次级免疫反应，导致B2M–/–类器官的免疫排斥反应。同时，B2M基因的敲除也不能防止HLA class II的表达，而HLA class II的表达会增加肾脏类器官的免疫原性，从而增加移植后的免疫排斥反应的风险。因此，调节HLA class II信号可能是防止移植后免疫排斥反应的必要手段。此外，本文还提出了一种新的评估肾脏类器官免疫原性的方法，即通过将特异性的细胞毒性T细胞与类器官共培养来评估其免疫原性。这种方法可以更准确地评估类器官的免疫原性，为移植手术的成功提供了更好的保障。
参考信息
T-Cell Mediated Immune Rejection of Beta-2-Microglobulin Knockout Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Kidney Organoids.Stem Cells Transl Med. 2023 Oct 16:szad069. doi: 10.1093/stcltm/szad069.PMID: 37843402.
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来源：培养盒守护者