新技术——高效便捷解决试验室『核酸污染』

摘要：分子实验是生物学研究过程中常用的实验技术。随着这类技术的普及与高度运用，科研人员发现，DNA、RNA，以及DNase和rnase污染会PCR分子生物学实验的准确性和灵敏性。

分子实验是生物学研究过程中常用的实验技术。随着这类技术的普及与高度运用，科研人员发现，DNA、RNA，以及DNase和rnase污染会PCR分子生物学实验的准确性和灵敏性。

由于PCR实验自身的特性，基于PCR的方法可能会错误地扩增或检测到甚至单个DNA、RNA分子污染，导致PCR伪影、不准确的数据以及经常出现假阳性结果。

此外，DNA酶、RNA的酶广泛存在于实验环境中，通过降解RNA分子显著影响下游应用。

因此，祛除DNA、RNA，以及DNase和RNase污染十分重要。

德国Minerva Biolabs公司针对实验室常用的核酸污染祛除试剂，在常见的仪器、物品的污染祛除效果进行了检测，并对其结果进行了详细的阐释。

一、祛除DNA污染的效果检测

检测PCR Clean™祛除大肠杆菌0104和大肠杆菌0157中细菌扩增子DNA的效率，并与其他几种清洁材料进行比较。

将2µl （0.05 ng）大肠杆菌0104 DNA移入塑料箔、玻璃表面和实验室工作表面（Trespa®），或将2µl （0.2 ng）大肠杆菌0157 DNA、大肠杆菌质粒DNA移至有机玻璃®和铝表面。

在DNA完全风干后，使用一张纸巾，用PCR Clean™、稀释的洗洁精、70%乙醇、异丙醇、水或干纸巾湿润后，分别轻轻擦去DNA滴入的地方，将DNA祛除。

然后用湿润的棉签擦拭同一区域来收集样本。作为阳性对照，直接将0.05 ng大肠杆菌0104 DNA（用于塑料箔，玻璃或Trespa®检测）、0.2 ng大肠杆菌0157 DNA（用于有机玻璃®和铝检测）2 ×10^6基因组拷贝的大肠杆菌基因组DNA或2 ×10^6基因组拷贝的大肠杆菌质粒DNA，移液到250µl PCR级水中，并以与其他样品相同的方式进行提取。

结果显示，与其他清洗剂和阳性对照相比，PCR Clean™从测试的各个表面祛除扩增子DNA后，扩增子DNA的损耗更大（表1）。对于所有测试的表面，PCR Clean™显示出祛除扩增子DNA的最佳效果，这可以在图1中观察到。无论表面材料如何（图1，a - e）， PCR Clean™的Ct值均高于其他清洗剂和阳性对照（图1，a - e），表明DNA量减少幅度较大。

表1.使用PCR Clean™与其他清洗剂比较，从不同表面祛除扩增子DNA后的qPCR扩增的Ct值。

图1.使用不同清洗剂从a . plexglass®、B. aluminum、C. Trespa®、D.Glass和E. Plastic foil中祛除大肠杆菌扩增子DNA后的qPCR扩增曲线（详见上图）。

结果显示，与水和干纸巾相比，用PCR Clean™从铝表面祛除基因组DNA和质粒DNA后，与阳性对照相比，基因组DNA和质粒DNA的损耗更大（表2）。这也可以在图2中显示，其中基因组DNA扩增的ct值(图2，A)和PCR Clean™祛除后质粒DNA扩增的ct值（图2，B）高于其他清洗剂祛除后的ct值，也高于阳性对照，表明DNA量减少幅度更大。

表2.使用PCR Clean™从铝表面祛除基因组DNA或质粒DNA后，与水和干纸巾进行比较，用qPCR扩增测量ct值。

图2.使用PCR Clean™、H2O或干纸巾从铝表面祛除后，大肠杆菌基因组DNA或大肠杆菌质粒DNA的qPCR扩增曲线

二、祛除RNA的效果检测

使用德国MB公司的ExtractNow™RNA提取试剂盒从人细胞中提取RNA。测量RNA浓度，并在plexglass®表面的6个不同点上各移液5µg（11µl）。

RNA完全风干，然后分别使用含有PCR Clean™、稀释的洗洁精、70%乙醇、异丙醇、水或干纸巾的纸巾，通过擦拭污渍，将RNA移液。

用湿润的棉签擦拭同一区域收集样本。

携带所收集的RNA样本的拭子转移到400µl裂解缓冲液中，使用ExtractNow™RNA提取试剂盒提取RNA。作为阳性对照，将人细胞中提取的5µg RNA直接转移到400µl裂解缓冲液中，并以与其余样品相同的方式处理。对包括阳性对照在内的所有RNA样本进行逆转录，然后对合成的cDNA样本进行qPCR。

结果显示，与其他清洗剂和阳性对照相比，PCR Clean™从plexglass®表面祛除RNA后，RNA的损耗更大（表3）。这也可以在图3中显示，其中cDNA扩增的ct值，由RNA通过逆转录合成，与其他清洗剂祛除RNA后的ct值和阳性对照相比，PCR Clean™祛除RNA后的ct值更高，表明RNA量的减少幅度更大。

表3.使用PCR Clean™从plexglass®表面祛除RNA后，通过逆转录从RNA合成cDNA的qPCR扩增测量ct值，并与不同清洗剂进行比较。

图3.用不同的清洗剂从plexglass®中祛除RNA后，通过逆转录由RNA合成的cDNA的qPCR扩增曲线（详情见上图）。

三、祛除DNases的效果检测

科研人员还测试了PCR Clean™和PCR Clean™Wipes对玻璃表面dna酶的祛除能力。简而言之，DNase I(1µl, 3u /µl, Applichem, Cat.；将No.A3778.0010)移液到玻璃表面风干。接下来，用干纸巾、70%异丙醇浸泡液、PCR Clean™浸泡液或PCR Clean™ Wipes擦拭。

使用基因组DNA （gDNA）标准物作为底物/指示剂，通过qPCR间接测量DNA酶的酶活性来鉴定持续的DNA酶污染。

简单地说，在擦拭步骤后，将20µl gDNA （M.gallisepticum，10^3个基因组拷贝/µl， 10mM MgCl2在PCR级水中）添加到DNA预包被的点上。

然后通过上下移液10次收集污染的DNase及其底物gDNA的混合物，并在37°C下孵育15分钟，以允许酶促反应（消化）发生。

然后通过评估microstart®ATMP支原体（Sartorius STEDIM Biotech） qPCR扩增的性能来推断由于污染DNA酶引起的相关DNA降解。作为qPCR反应完全受损的参考，科研人员纳入阳性对照，采用20µl的gDNA（10^3个基因组拷贝/µl）在37℃下孵育15分钟，获得阳性对照。同样的程序用于产生阴性对照，不添加DNase I。

实验结果，在用不同方法进行去污后，通过在DNase污染点上添加gDNA（鸡毒支原体，103 C/µl）的qPCR来评估DNase（3 U）的有效祛除率。

在qPCR之前，从污染的玻璃表面收集gDNA和DNase的混合物，并在酶反应的最佳条件下孵育。当没有观察到qPCR反应受影响时，认为净化完成。这是通过用PCR Clean™湿巾或PCR Clean浸湿的纸巾擦拭来实现的，正如成功扩增掺入的gDNA所证明的那样。

从PCR Clean™湿巾或PCR Clean浸湿纸巾处理过的表面样本中，获得的掺入gDNA的Ct值与阴性对照相当，在gDNA掺入之前没有吸过DNase（表5）。

省略擦拭步骤，使用干燥的纸巾或用70%异丙醇润湿的毛巾，通过之前添加的DNase诱导gDNA大量降解（无Ct，表5）。在阳性对照组中观察到类似的完全降解，在最佳反应条件下允许DNases诱导的DNA降解发生。图5显示了阈值以上的清晰扩增曲线，仅适用于经PCR Clean™处理的表面和阴性对照，从而证实了qPCR性能因所用祛除剂而异。

表5.使用随后的DNA回收作为去污效率的指标，在表面清洁后残留的DNA酶活性。该表显示了与对照组相比，掺入DNase预涂玻璃表面的gDNA的qPCR Ct值，后来用几种方法擦拭。通过最佳酶消化（阳性对照）获得的扩增缺失（无Ct）表明DNA明显依赖于DNA酶降解，阻碍了qPCR。同样，低效的净化方法也会导致qPCR受损。斑点靶标的成功扩增（在阴性对照的2 Ct值内）表明，之前污染的DNase被显著祛除。

图5.在应用了几种清洁方法后，在DNase污染的玻璃表面上添加gDNA的qPCR扩增曲线与对照条件进行了比较（详见下文图例）。

四、祛除RNases的效果检测

科研人员测试了PCR Clean™（喷雾和预湿湿巾）祛除玻璃表面RNases的能力。

简单地说，将RNase A（5µl，0.03 U/ml甘油，Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）转移到先前净化过的玻璃表面上，并在室温下孵育30分钟。

接下来，用干燥纸巾、PCR Clean™ Wipes或用含有70%异丙醇、PCR Clean™或市售的RNase去污剂RNaseZap®（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）的纸巾擦拭实验点，15秒接触时间后可重复擦拭。

在控制条件下进行RNase污染后，50µl无核酸酶的H2O (Thermo Fisher Scientific, Cat；No.AM1964)添加到预污染点并上下移液10次以收集任何存在的RNase。

然后将这些样品中的45µl用于市售的荧光检测RNaseAlert®（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）。该试剂盒是按照制造商的建议使用的。随后，在37°C孵育期间测量原始荧光（ex 490/em 520），最多每5分钟一次。使用CFX96 Touch™（Bio-Rad） 2小时。

实验结果，在表面清洁或未清洁后，使用市售的基于荧光的RNase活性测定来评估RNase的有效祛除。在分析之前，通过彻底的点移液对表面进行取样，包括省略RNase（阴性对照）或擦拭（阳性对照）的表面，并用基于荧光的方法RNaseAlert®（ThermoFisher Scientific）进行分析。在未进行擦拭的样品中，始终观察到严重污染的RNase活性（图6A，紫色曲线，代表性结果）。与阴性对照组一样，当没有测量到RNase的残留活性时，认为净化完成。

就荧光信号而言，根据试剂盒制造商的建议，将截止值定义为阴性对照荧光的2.5倍（图6A，红色虚线）。基于该参数，在至少2或3个重复实验中，省略擦拭步骤、使用干纸巾或用70%异丙醇润湿的毛巾不会抑制RNase的活性（表6和图6）。为了更好地突出阴性对照和其他清洁方法之间的差异，图6B中显示了图6A（黑色矩形）的相应缩放区域。只有在用PCR Clean™（预湿湿巾和浸湿的纸巾）或RNaseZap®浸湿的纸巾擦拭后，才能实现显著和可重复的去污，即使在37°C下孵育2小时后，荧光水平也很低（图6和表6）。

图6.RNaseAlert™（赛默飞世尔科技公司）用于分析RNase污染的代表性荧光曲线。A、与对照条件相比，用几种方法擦拭污染的玻璃表面后评估了RNase活性（不擦拭：阳性对照；没有发现RNase：阴性对照）。在严重污染的样本中观察到快速稳定的荧光信号，而RNase量可忽略不计的样本显示出与阴性对照相似的趋势。采用阴性对照（红色虚线）的RFU的2.5倍作为临界值，以区分污染和非污染样品。为此，所有实验组的RFU值在平台期（推荐的孵育时间后）通过10次测量取平均值。在B中，显示了图A的缩放部分（黑色矩形）。

表6.用几种方法祛除污染后，玻璃表面仍有核糖核酸污染。通过使用干毛巾、异丙醇浸泡、PCR Clean™浸泡、RNaseZap®（Thermo Fisher Scientific）浸泡纸巾或PCR Clean™湿巾擦拭被rnase污染的玻璃表面，成功地（−，未污染）或（+，未污染）清洁。通过平均荧光值（超过10次测量）确定了表面（+）的持续RNase污染，该值至少比阴性对照高2.5倍。显示RFU低于该截止值的样品被认为未受污染（−）。在控制条件下重复实验3次。

五、总结

通过参考每种qPCR检测的阳性对照计算ΔCt值，确定使用PCR Clean™或其他清洁剂祛除核酸后核酸的耗尽情况（表4）。结果显示，无论用于测试的表面材料如何，PCR Clean™祛除后扩增子、基因组和质粒DNA的消耗以及RNA的消耗都高于任何其他清洁剂（表4，ΔCt值为红色）。

PCR Clean™对所有测试表面的扩增子、质粒和基因组DNA以及RNA污染都非常有效，即使在使用后几秒钟内也是如此。评估核酸酶祛除的实验也表明，PCR Clean™（喷雾和擦拭）对玻璃表面的DNases和RNases进行了有效的净化。消耗结果还表明，与分子生物学实验室中通常可用的最常见的清洁剂（如乙醇、异丙醇或洗碗剂）相比，PCR Clean™在有效性和效率方面具有优势。此外，科研人员发现PCR Clean™（喷雾和湿巾）和常用的RNase清洁产品RNaseZap®的RNase净化效率相当。

因此，在PCR分析前后定期使用PCR Clean™是快速、简单和能够高效起作用的，可以保持工作区域的清洁，这在分子生物学实验室和PCR工作站中十分重要，可以节省实验时间和相关的费用。