摘要：该模型首次实现了肝细胞、内皮细胞、间充质细胞与免疫细胞的共同培养，显著提升了类器官的生理相关性。KuLO不仅能模拟肝脏发育与炎症反应，还为研究肝病机制与药物筛选提供了全新平台。
本研究利用人诱导多能干细胞（iPSC）成功构建含有库普弗细胞（肝脏驻留巨噬细胞）的肝类器官（KuLO）。
该模型首次实现了肝细胞、内皮细胞、间充质细胞与免疫细胞的共同培养，显著提升了类器官的生理相关性。KuLO不仅能模拟肝脏发育与炎症反应，还为研究肝病机制与药物筛选提供了全新平台。
文章介绍
题目：使用人iPSC产生含库普弗细胞的肝类器官的方案
英文题目：Protocol for generating liver organoids containing Kupffer cells using human iPSCs
杂志：STAR Protocols
影响因子：1.3
PMID：41075253
发表时间：2025年10月
肝脏是人体内具有复杂细胞组成和免疫功能的重要器官，其中库普弗细胞作为肝脏特有的巨噬细胞，在免疫调节、炎症反应和组织修复中发挥关键作用。
然而，传统的肝类器官模型多缺乏免疫细胞成分，限制了其在模拟肝脏免疫微环境及疾病机制研究中的应用。近年来，基于iPSC的类器官技术虽取得显著进展，但如何高效、稳定地将免疫细胞（尤其是组织驻留型巨噬细胞）整合入类器官仍具挑战。
本研究通过分阶段诱导iPSC分化为红细胞-髓系祖细胞（EMP）与肝内胚层（HE），并结合内皮与间充质细胞，成功构建了包含功能库普弗细胞的肝类器官，为研究肝脏发育、免疫应答及疾病建模提供了更接近生理状态的体外模型。
Part.01
研究思路
为解决传统肝类器官缺乏库普弗细胞的问题，本研究在获得肝内胚层、内皮细胞、间充质细胞及EMP后，将其按精确比例在U型底微孔板中共培养，自组装形成类器官，并在含M-CSF的培养基中培养约14天，促使EMP分化为功能成熟的库普弗细胞，同时提升肝细胞功能，最终构建出含功能性库普弗细胞的肝类器官。
Part.02
研究设计
分化肝内胚层（16-26）、生成EMP前体（1-15）、三维共培养组装（27-34）、功能成熟与鉴定（35-40）。
实验步骤
从人iPSC分化红细胞-髓系祖细胞（EMP）：12天
本部分描述了从人iPSC生成EMP的程序（图2A）。为启动EMP分化，将人iPSC以低密度接种，以形成独立的细胞集落。随后，通过添加不同配方的培养基来驱动生血内皮和EMP（CD43⁺CD34⁺CD115⁺）的特化。除非另有说明，所有操作应在室温（20℃-25℃）下进行。
图2 (A) EMP分化的示意图。(B) EMP分化的代表性细胞形态。在第0天，iPSC集落形成，密度稀疏。箭头：突出的细胞簇，为正在分化的造血祖细胞。(C) 在分化第3天和第5天，生成的KDR⁺CD34⁺中胚层祖细胞的代表性流式细胞术图。(D) 在第8至10天收获的iPSC来源的EMP中，CD43、CD34和CD115表达的代表性流式细胞术图。
1. 规划实验所需孔数，并额外准备两个检测孔。用iMatrix-511包被12孔板
2. 吸弃包被液，加入含Y-27632的AK02N培养基，置于培养箱备用。
3. 使用Accutase解离人iPSC。
4. 将细胞重悬于含Y-27632的AK02N中，并测定细胞浓度。
5. 将300个iPSC接种至一个包被孔中，并于24小时和76小时后换液。
关键步骤：如果细胞密度过高无法准确接种300个细胞，请稀释人iPSC悬液。通常如果iPSC收集自6孔板的一个孔，需要进行100倍稀释。将接种的iPSC最终体积保持在50 μL以下。
6. 第4天，吸弃旧培养基，加入EMP分化培养基A，此日定为分化第0天。
7. 分化第2天，弃去500 μL旧液，加入等量新鲜培养基A。
注意：进行半量换液有两个原因：第一，减少培养环境的突然变化；第二，降低iPSC分化的成本。
8. 分化第3天，吸弃全部旧液，更换为EMP分化培养基B。
9. 分化第5天，弃去500 μL旧液，加入等量新鲜培养基B。
注意：在分化第5天，可在贴壁细胞上发现小的细胞簇（图2B）。
注意：我们建议使用流式细胞术检测第3天和第5天中胚层祖细胞（KDR⁺CD34⁺）的出现情况（图2C）。
10. 分化第7天，吸弃全部旧液，加入新鲜培养基B。
注意：在分化第7天可发现悬浮细胞。这些细胞包括在体外分化早期产生的原始造血细胞。为富集定型的EMP并减少在第8天收获的悬浮细胞的异质性，我们去除在第7天之前产生的悬浮细胞。
11. 分化第8天，收集含有造血细胞的上清液。
12. 用DMEM轻轻吹洗孔壁，收集残留细胞，合并后离心。
13. 用DMEM重悬细胞沉淀并再次离心。
14. 将最终细胞沉淀重悬于DMEM，计数后置于冰上备用。
15. 取部分细胞，使用流式细胞术检测CD43、CD34、CD115等表面标志物以验证EMP。
注意：可通过在收获后向孔中补充新鲜培养基B将分化延长至第10天。然而，细胞表型可能会发生轻微变化（图2D）。这可能是由于悬浮的造血祖细胞在增殖过程中表型发生变化，或不同时间点产生的祖细胞之间存在表型差异。我们建议使用流式细胞术检查每批的分化效率，并进行集落形成实验以评估这些祖细胞的潜能。
从人iPSC分化肝内胚层：10天
定形内胚层特化和肝内胚层分化（图3A）。在开始分化前，至少需要提前2周培养和扩增人iPSC。
图3 (A)从iPSC分化肝内胚层的示意图。(B)肝内胚层分化的代表性细胞形态。(C)hiPSC来源的肝内胚层中EpCAM、CD133和CXCR4表达的代表性流式细胞术图。(D)在iPSC肝内胚层分化过程中，多能性标志物（NANOG, POU5F1）、定形内胚层标志物（CXCR4, CER1）和肝内胚层标志物（HNF4A, AFP）基因的相对表达水平。
16. 准备一个10 cm细胞培养皿并用iMatrix-511包被。
a.向培养皿中加入10 mL PBS，并补充70 μL iMatrix-511。
b.将培养皿在37℃、5%CO₂培养箱中孵育1小时，然后用10 mL新鲜PBS替换包被用的PBS。
c.将包被好的培养皿置于培养箱中或细胞培养超净工作台上，室温（20℃-25℃）保存，并于当天使用。或者包被好的培养皿可在4℃下储存长达一周。
注意：根据分化结束时目标细胞数量选择细胞培养板。
17. 使用Accutase解离iPSC。
18. 将细胞重悬于1-2 mL AK02N培养基中，并测定细胞浓度。
19. 使用AK02N培养基将细胞密度调整至1×10^7细胞/毫升，并将细胞置于冰上直至使用。
20. 在10 mL定形内胚层分化基础培养基中补充2 μM CHIR99021和10 μM Y-27632，制备用于接种肝内胚层的培养基。将包被好的10 cm培养皿中的PBS替换为10 mL制备好的培养基。
21. 向培养皿中加入500 μL iPSC细胞悬液（5×10^6），通过轻轻晃动培养皿5秒混匀。将培养皿放回37℃、5% CO₂培养箱中。这一天定为分化第0天。
22. 在24小时后（第1天）和48小时后（第2天），弃去旧培养基，更换为10 mL补充了2 μM CHIR99021和500 μM丁酸钠的定形内胚层分化基础培养基。
23. 在72小时后（第3天），弃去旧培养基，更换为10 mL补充了500 μM丁酸钠的定形内胚层分化基础培养基。
24. 在96小时后（第4天），弃去旧培养基，更换为10 mL定形内胚层分化基础培养基。培养24小时。
25. 从第5天开始，每24小时弃去旧培养基，更换为10 mL肝内胚层分化培养基。
注意：密切观察分化过程中的细胞形态变化。在第10天，应出现具有清晰边界的多角形细胞（图3B）。
26. 在分化第10天，收获细胞用于共培养：
a.弃去培养基。用10 mL PBS润洗细胞一次。
b.弃去PBS，加入2 mL 0.05% Trypsin-EDTA。将培养皿在37℃、5% CO₂培养箱中孵育5分钟。
c.使用1 mL吸头轻轻吹打，检查细胞是否完全解离。如果细胞仍然贴壁，则将孵育时间延长2-3分钟。
d.一旦细胞完全解离，加入8 mL含10% FBS的DMEM培养基以终止消化。
e.轻轻将细胞收集到15 mL锥形管中。以200 g离心4分钟。
f.弃去上清液，加入10 mL DMEM基础培养基洗涤细胞沉淀一次。以200 g离心4分钟。
g.弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL补充了10 μM Y-27632的DMEM基础培养基中。
h.测定细胞数量。我们推荐使用台盼蓝染色进行细胞计数以检测细胞活力。
i.将细胞置于冰上直至共培养。
j.若要通过流式细胞术检查分化效率，请参考步骤15。若要通过qRT-PCR检查基因表达，将至少1×10^5个细胞转移到1.5 mL Ep管中，使用商业试剂盒进行细胞裂解和RNA提取。我们推荐使用两步法qRT-PCR和基于SYBR green染料的方法进行qPCR分析。
注意：我们推荐使用流式细胞术和qRT-PCR分析来检查分化效率。在分化第10天，超过95%的细胞应表达肝内胚层标志物CD326（EpCAM）和CD133，而定型内胚层标志物CXCR4（CD184）的表达应较低（图3C）。在分化过程中，细胞应下调多能性基因（如NANOG和POU5F1），并上调肝内胚层标志基因（如HNF4A和AFP）。定形内胚层标志物（CXCR4和CER1）应在分化过程中短暂上调（图3D）。
共培养人iPSC来源的EMP、HE、EC和MC以生成KuLO：14天
一个24孔板的单孔内可共培养约550个类器官。在共培养期间，EMP及其后代主要存在于类器官外部周围（图4A）。同时，肝类器官经历功能成熟。共培养约2周后，将建立起功能性的KuLO。
图4 (A)共培养期间KuLOs的代表性细胞形态。(B)共培养中EMP来源的造血细胞其CD45、CD14和CD163表达的代表性流式细胞术图。(C)共培养第14天的KuLO内部，显示肝细胞（HNF4α，红色）和库普弗细胞（CD68，绿色）的最大强度投影图像。
27. 准备用于共培养的Elplasia U底板。
a.向24孔Elplasia U底板的每个孔中加入500 µL PBS。
b.将培养板以1800 g离心1分钟。
c.确定用于共培养的孔。从这些孔中吸弃PBS，并用500 µL补充了10 µM Y-27632的KuLO培养培养基润洗一次。本次不使用的孔内请保留PBS。
d.吸弃润洗培养基，将培养板置于细胞培养超净工作台中备用。
28. 计算共培养所需的细胞数量
29. 按各章节所述方法收获人iPSC来源的HE和EMP。
30. 向一个15 mL锥形管中加入1 mL KuLO培养培养基。
31. 将计算好数量的新鲜收获的HE、EC、MC和EMP加入15 mL管中。
32. 以300 g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量体积的补充了10 µM Y-27632的KuLO培养培养基中。
注意：我们建议重悬体积为每接种一个Elplasia 24孔板孔位使用500 µL KuLO培养基。例如，若要接种12个孔，则将细胞沉淀重悬于6 mL KuLO培养基中。考虑到移液损失，建议比实验计划多准备一个孔的细胞量，以免细胞不够用。
33. 使用1 mL吸头轻轻吹打细胞悬液，充分混匀。
34. 向Elplasia 24孔板的一个孔中加入500 µL细胞悬液。无需在孔内进行额外吹打。将所有细胞接种完毕后，将培养板放入37°C、5% CO₂培养箱中。这一天定为共培养第0天。6小时内，微孔中将会形成被EMP包围的细胞球体。
关键步骤：Elplasia板中的球体并未物理附着在微孔上。在拿取和转移培养板时动作要轻柔，避免扰动类器官。
35. 接种后约24小时（第1天），小心地更换为1 mL不含Y-27632的KuLO培养基。
a.在孔内选择一个固定的位置进行换液，并在后续换液中一直使用同一位置。我们建议使用孔的上端。
b.使用1 mL吸头低速吸除培养基，避免扰动类器官。我们建议吸取一个孔500 µL培养基的时间控制在4-6秒。
c.从同一位置低速加入1 mL新鲜KuLO培养基。我们建议向一个孔加入1 mL培养基的时间控制在6-8秒。
36. 将培养板在37°C、5% CO₂培养箱中培养，并每2天按步骤34所述小心更换培养基。
注意：换液过程中可能会吸走少量类器官。从孔的同一位置吸液有助于减少类器官的损失。
37. 在共培养期间，类器官将逐渐长大，周围的造血细胞会显著扩增，直至约共培养第6天。收集第4、7、10和14天的培养基，使用市售的ELISA试剂盒检测类器官的白蛋白分泌情况。KuLO的白蛋白分泌应持续增加直至约第12至14天，并能在相对稳定的水平维持至少一周。
收获并分析KuLO的不同细胞组分：1-3天
KuLO由经历分化和成熟的不同细胞谱系组成。具体来说，在M-CSF存在的情况下，EMP将分化为CD45⁺CD14⁺CD163⁺的库普弗细胞。
38. 分析类器官外部的EMP分化：
a.使用1 mL吸头在孔内不同位置轻轻吹打培养液4-5次，温和地搅动Elplasia板中的培养物。避免产生气泡。
b.将培养液和类器官转移至一个1.5 mL Eppendorf管中。通常，将24孔Elplasia板的1-2个孔收集的类器官和细胞收集于一个Eppendorf管中。静置管子2-3分钟，让类器官沉降到管底。
注意：或者可以50 g离心1分钟。
c.将上清液转移至一个15 mL管中；此上清液含有造血细胞。
d.向Elplasia孔中加入1 mL PBS，轻轻吹打，将所有剩余的类器官收集到Eppendorf管中。
e.让类器官沉降到管底。将上清液转移至15 mL管中。
f.向含有类器官的1.5 mL Eppendorf管中加入1 mL PBS，轻轻吹打（4-5次）。让类器官沉降，收集含有任何残留造血细胞的上清液。
g.将15 mL管以300 g离心5分钟。将沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中。
h.测定细胞浓度，并进行下游分析。
注意：我们建议在共培养第6、10和14天使用流式细胞术分析EMP分化。通常，收集24孔Elplasia板的2-3个孔的细胞用于流式细胞术分析。到第14天，超过90%的EMP应表达库普弗细胞标志物，包括CD45、CD14和CD163（图4B）。
39. 分析类器官内部的EMP分化：
a.用PBS洗涤收获的类器官（来自步骤38的Eppendorf管）一次。让类器官沉降。将Accumax预热至室温。
b.弃去PBS，加入1 mL Accumax。在室温下孵育20分钟。每隔10分钟使用1 mL吸头轻轻吹打一次。
c.以50 g离心1分钟。
d.将上清液转移至一个含有5 mL DMEM或PBS的新15 mL管（收集管）中。向含有未解离类器官的管中加入1 mL新鲜Accumax，在室温下孵育10分钟。轻轻吹打以促进解离。
e.以50 g离心1分钟。
f.将上清液转移至收集管。
g.向解离管中加入1 mL PBS。以50 g离心1分钟，并将上清液转移至收集管。
h.将收集管以300 g离心5分钟。
i.弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量体积的FACS缓冲液（PBS+2% FBS）中。用100 μm细胞筛网过滤细胞悬液，以去除未解离的细胞团块。
注意：过滤后的细胞悬液含有来自类器官的解离单细胞，包括造血细胞、肝细胞、内皮细胞和间充质细胞。为评估库普弗细胞的分化，建议使用CD45、CD14和CD163进行流式细胞术分析。对于其他细胞群体的分析，建议使用CD326（肝细胞）和CD31（内皮细胞）来分选感兴趣的细胞。请注意，由于存在未解离的细胞团块，流式细胞术观察到的不同细胞群体的比例并不能准确反映类器官的实际细胞组成。
40. KuLO的全标本免疫荧光染色：通常将24孔Elplasia板的1-2个孔收获的类器官收集于一个Eppendorf管中进行染色。
a.用PBS洗涤收获的类器官（来自步骤38的Eppendorf管）一次。静置管子2-3分钟或以50 g离心1分钟。
b.弃去上清液，加入1 mL冰冷的4%多聚甲醛（PFA）以固定类器官。在4°C下孵育1小时。
c.弃去PFA，加入1 mL PBS洗涤类器官。让类器官沉降。弃去上清液，重复此步骤一次。
d.加入1 mL冰冷的类器官洗涤缓冲液（OWB），在4°C下孵育至少1小时或过夜（14-16小时）。
e.弃去OWB，加入400 μL含有稀释后一抗的冰冷OWB。在4°C下孵育过夜（14-16小时）。
f.以50 g离心管子1分钟。弃去含有一抗的OWB上清液。加入新鲜OWB，在室温下振荡洗涤类器官10分钟。
g.重复上一步两次。弃去OWB上清液，加入400 μL含有二抗和DAPI的OWB。在室温下孵育3小时或在4℃下过夜（14-16小时）。
注意：我们建议测试用于全标本染色的抗体最佳浓度。
h.所有后续步骤均在室温下进行。以50 g离心管子1分钟。弃去含有二抗的OWB上清液。加入1 mL新鲜OWB，振荡洗涤类器官10分钟。
i.以50 g离心管子1分钟。弃去上清液，加入1 mL新鲜OWB，振荡洗涤类器官10分钟。重复此步骤一次。
j.共聚焦成像的折射率匹配：可能弃去OWB。加入50% CUBIC-R+(M)（用水稀释），孵育10分钟。以300-400 g离心管子1分钟。弃去上清液，加入100% CUBIC-R+(M)（折射率：1.520）。将类器官保留在此溶液中，室温保存直至成像。
k.成像时将类器官悬液转移至适用于共聚焦成像的培养皿中。图4C显示了用肝细胞和库普弗细胞标志物染色的类器官代表性图像。
注意：类器官在进行折射率匹配后可能变得难以观察。操作需小心，以免在转移过程中意外损失样品。应尽快进行成像。
预期成果
功能性肝类器官的建立：本方案成功构建了功能成熟的肝类器官，其白蛋白分泌、药物代谢酶活性等关键肝功能在培养约14天后显著提升并维持稳定。
功能性库普弗细胞的成功整合：方案成功将iPSC来源的EMP在共培养体系中诱导分化为表达典型标志物（CD45/CD14/CD163）并具备特定基因功能的功能性库普弗细胞。
具备疾病建模能力：生成的KuLOs能有效响应内毒素刺激，模拟出库普弗细胞激活、炎症因子释放、肝功能可逆性损伤这一完整的急性炎症病理过程。
局限性
尽管KuLO能够分泌白蛋白并展现一定的肝脏功能，但其成熟度仍有限，无法与原代人肝细胞相比。
此外，虽然KuLO中包含内皮细胞，但由于细胞数量有限，它们未能完全重现肝脏中复杂的血管网络结构。若要进行与内皮相关的研究，建议增加内皮细胞的接种密度或优化共培养培养基。
故障排除
问题1：人iPSC分化EMP的效率低下（步骤1-15）。从EMP分化第7天起，可在悬浮液中观察到圆形的造血细胞。然而，iPSC或细胞因子质量不佳（通常因在4℃下储存时间过长所致）会导致分化效率低和细胞产量减少。
潜在解决方案：在步骤5中，优化人iPSC的接种密度，确保在更换为培养基A前，细胞能生长成稀疏的单细胞集落。我们建议通过接种不同细胞数（例如，在12孔板中每孔接种100、300、600和1200个细胞）进行预实验，并比较细胞产量。在步骤6-10中，为每批分化制备新鲜的培养基。将细胞因子和生长因子分装成单次使用体积并冷冻保存。
问题2：人iPSC分化HE的效率低下（步骤16-26）。成功分化的HE是具有清晰边界的多角形细胞（图3B）。我们建议使用免疫染色和基因表达分析来检测分化不同时间点的特异性标志物。
潜在解决方案：在步骤16中，使用早期传代的人iPSC系（少于25代）以保持其分化潜能。优化人iPSC的接种密度，确保有足够数量的细胞用于HE特化。在步骤16-25中，使用新鲜的细胞因子和生长因子为每批分化制备培养基。
问题3：在共培养第1天未能形成肝类器官（步骤35）。细胞未能聚集成簇，仍然分散在微孔中。这可能源于HE分化效果不佳、HE存活率低，或接种培养基中缺少ROCK抑制剂Y-27632。
潜在解决方案：优化HE分化（参见问题2）。在共培养接种前评估HE的存活率。如有需要，优化收获程序以提高存活率（步骤26）。例如，在步骤26c中缩短细胞解离时间；在收获过程中减少吹打的时间和力度。确保在细胞接种培养基中添加Y-27632（步骤32）。
参考文献
Li, Y., Nie, Y., & Taniguchi, H. (2025). Protocol for generating liver organoids containing Kupffer cells using human iPSCs. STAR protocols, 6(4), 104138. doi：10.1016/j.xpro.2025.104138.
来源：培养盒守护者
