摘要：做CO-IP实验的姐妹们，你们是不是也经常面对条带神秘消失、模糊不清或者位置不对的困扰？我在实验室摸爬滚打这么多年，终于总结出这些"流浪条带"背后的真相！

做CO-IP实验的姐妹们，你们是不是也经常面对条带神秘消失、模糊不清或者位置不对的困扰？我在实验室摸爬滚打这么多年，终于总结出这些"流浪条带"背后的真相！

1️⃣ 裂解缓冲液成分或pH值不合适 🧪

🚫 问题：裂解液就像蛋白质的"泳池"，成分和pH不对，蛋白质就会不舒服！

我曾经因为用了过于温和的RIPA缓冲液，导致膜蛋白根本没被有效溶解，白白浪费了一周的时间😭。分子层面上，缓冲液的离子强度和pH会直接影响蛋白质的构象和相互作用！

💡 关键点：膜蛋白需要更强效的裂解液(含更高浓度SDS或去垢剂)，而细胞质蛋白则可以用温和一些的。pH值偏离蛋白质等电点太远，会影响抗原表位暴露，导致抗体无法识别目标蛋白！

2️⃣ 抗体特异性或用量问题 🔬

⚠️ 曾经我就因为贪图便宜买了便宜抗体，结果西伯利亚产的抗体带我去西伯利亚旅游了一圈，连个影子都没看到🙃

抗体就像是在人海中找特定朋友的"眼睛"，如果这个"眼睛"近视了(特异性低)或者数量太少，怎么可能准确找到目标蛋白呢？

分子层面解释：抗体与抗原的亲和力不足，或者抗体用量不足，会导致免疫复合物形成效率低下，IP效率直线下降！而过量抗体又会增加非特异性结合，让背景一片花哨～

3️⃣ 洗涤步骤过严或不足 🚿

这个真是太常见了！洗得太狠，条带被"洗没了"；洗得太轻，背景脏得看不清条带😂

🌊 洗涤就像是淘金，水流太猛会把金子冲走，太小又洗不干净沙子。在分子层面，洗涤缓冲液的盐浓度和洗涤次数直接决定了弱相互作用是否被破坏！

记得有次我急着下班，洗涤时间缩短了，结果Western blot出来的条带背景高得像北京的房价，根本看不清目标条带在哪里😅

4️⃣ 样品制备过程中蛋白质降解 ⏱️

⚠️ 蛋白质就像冰激凌，放久了就"融化"了！

全程4℃操作不是随便说说的！我有次夏天实验室空调坏了，样品在室温放了不到半小时，最终的结果就是——什么也没看到🙈

分子层面上，细胞裂解后释放的蛋白酶会迅速降解目标蛋白，特别是一些半衰期短的蛋白质。即使加了蛋白酶抑制剂，如果操作不当(如反复冻融、高温处理)，也会导致蛋白质变性或降解！

5️⃣ 蛋白质表达水平过低 🔍

这个问题超级烦人！明明设计的实验没问题，但是如果目标蛋白本身表达量就低得可怜，那CO-IP根本就是大海捞针啊！😫

我曾经研究的一个转录因子，表达量低到哭，试了3个月才优化出可见条带的方法。其实从分子生物学角度看，许多关键调节蛋白(如转录因子、激酶)的细胞内含量本来就很低，仅为总蛋白的极小部分。

📊 提示：低丰度蛋白需要更多的起始材料(细胞/组织)，更高效的IP抗体，甚至可能需要先进行蛋白质富集步骤！

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来源：毕合生物MBC