摘要：在过去的几年里，信使RNA（messenger RNA, mRNA）技术无疑是生命科学领域最耀眼的明星。它以一种前所未有的速度，为我们带来了对抗新冠病毒的有力武器，也为肿瘤免疫、罕见病治疗等领域推开了一扇充满希望的大门。然而，在这片璀璨星光的背后，一个根本性的
在过去的几年里，信使RNA（messenger RNA, mRNA）技术无疑是生命科学领域最耀眼的明星。它以一种前所未有的速度，为我们带来了对抗新冠病毒的有力武器，也为肿瘤免疫、罕见病治疗等领域推开了一扇充满希望的大门。然而，在这片璀璨星光的背后，一个根本性的挑战始终困扰着所有研究人员：mRNA分子本身是一种极其“短命”的信使。它就像一张“阅后即焚”的指令便条，在细胞内递送完蛋白质合成的蓝图后，便会被迅速降解。这种固有的不稳定性，极大地限制了mRNA疗法在需要长期、稳定表达蛋白质的场景下的应用，比如遗传性酶缺乏症的替代疗法或利用身体自身生产治疗性抗体。
我们能否为这位“短命信使”找到一种方法，让它在体内停留得更久一些，工作得更有效率一些？传统的方法，如环状RNA（circular RNA, circRNA），虽然延长了寿命，却牺牲了效率。
11月7日，《Nature Biotechnology》的研究报道“RNA stability enhancers for durable base-modified mRNA therapeutics”，为我们揭示了一个巧妙而强大的解决方案。研究人员将目光投向了自然界最古老的“分子黑客”——病毒。他们从近20万个病毒基因片段中，筛选出了一系列能够显著增强mRNA稳定性和翻译效率的“魔法序列”。其中一个名为A7的元件，其表现尤为惊人，它赋予了线性mRNA堪比环状RNA的超长“待机时间”，同时蛋白质表达效率却远超后者，在动物实验中实现了长达两周的持续表达。这不仅是一次技术的突破，更可能开启RNA药物的新纪元。
要理解这项研究的颠覆性，我们首先需要深入了解mRNA在细胞内的命运。当一条通过体外转录（in vitro transcription, IVT）技术合成的mRNA分子，通过脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNP）等递送系统进入细胞质后，它的生命便进入了倒计时。这个倒计时的“沙漏”，主要就是其尾部的一串多聚腺苷酸（poly(A)）尾。
在细胞质中，存在一个名为CCR4-NOT的蛋白复合物，它像一把不知疲倦的剪刀，不断地从poly(A)尾的末端剪切腺苷酸，这个过程被称为“去腺苷酸化”（deadenylation）。当poly(A)尾被缩短到大约25个核苷酸以下时，保护mRNA的“帽子”结构就会被移除，整个分子随之被迅速降解。poly(A)尾不仅是稳定性的标志，它还是高效翻译的“通行证”。poly(A)结合蛋白（PABPC）会结合在这条尾巴上，并与“帽子”一端的翻译起始因子相互作用，形成一个闭环结构，极大地促进蛋白质的合成。因此，维持poly(A)尾的完整性，是延长mRNA寿命和提升其工作效率的核心。
为了应对这一挑战，研究人员已经发展出多种策略。其中最著名的，莫过于对mRNA进行化学修饰，例如将尿苷（uridine）替换为N¹-甲基假尿苷（N¹-methylpseudouridine, m1Ψ）。这种修饰能够巧妙地“伪装”mRNA，使其躲过细胞内天然免疫系统的监视，从而降低免疫原性，同时也附带提升了一定的稳定性。目前广泛应用的mRNA疫苗，正是得益于这项关键技术。
此外，还有一些“结构创新”的尝试。例如，环状RNA（circRNA），它没有头尾之分，因此能够抵抗从末端开始降解的核酸外切酶，稳定性极佳。但它的缺点也同样明显：翻译效率普遍较低，且依赖于效率不高的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites, IRES）来启动蛋白质合成，并且其与化学修饰的兼容性不佳。另一种自扩增RNA（self-amplifying RNA, saRNA），源于病毒，能在细胞内自我复制，从而放大信号，但其复制过程中产生的双链RNA（dsRNA）中间体，容易引发强烈的免疫反应，带来了安全隐患。
这些现有方案，似乎都陷入了一种“鱼与熊掌不可兼得”的困境。我们能否找到一种方法，既保留线性mRNA制造简单、翻译高效的优点，又能赋予其环状RNA那样的超凡稳定性？
在开启宏大的探索之前，研究团队首先进行了一项看似常规的验证性实验，然而，正是这个实验，揭示了一个出乎意料的现象，并为整个研究指明了方向。
他们想知道，那些在文献中报道过的、或者已在商业化疫苗中应用的3'非翻译区（3' untranslated region, 3'UTR）元件，在与m1Ψ这种化学修饰联用时，效果究竟如何。3'UTR是mRNA上的一段关键调控区域，它不编码蛋白质，但可以招募各种调控蛋白，从而决定mRNA的稳定性、定位和翻译效率。
研究人员首先测试了两种商业化新冠疫苗的3'UTR：来自Moderna疫苗（mRNA-1273）的3'UTR（源于人α-珠蛋白基因）和来自辉瑞/BioNTech疫苗（BNT162b2）的3'UTR（一段融合序列）。结果显示，在m1Ψ修饰的mRNA背景下，这两种3'UTR的表现在体外实验中差强人意，与一个普通的对照序列相比，并没有表现出压倒性的优势，BNT162b2的3'UTR仅带来了微弱的表达提升。
更令人惊讶的结果来自于他们对一组之前自己筛选出的病毒源稳定元件（代号为K1-K9）的测试。在未经化学修饰的普通mRNA中，这些元件曾表现出强大的基因表达增强能力。然而，当它们被整合到m1Ψ修饰的mRNA中时，奇迹消失了。数据显示，包括K1, K2, K5, K6, K7, K8和K9在内的大多数元件，几乎完全失去了活性。只有K3和K4保留了部分功能，但效果也大打折扣。
这个发现无疑是当头一棒。m1Ψ修饰，本是为了提升mRNA的整体性能，却似乎“背叛”了这些曾经的“稳定盟友”，让它们失灵了。这引出了一个深刻的问题：为什么会这样？一种可能的解释是，m1Ψ修饰改变了RNA的局部结构和化学性质，从而破坏了这些元件与细胞内稳定因子蛋白的相互作用。这也揭示了一个关键的知识空白：我们迫切需要寻找新型的、能够与m1Ψ修饰完美兼容，并能强力提升mRNA稳定性的RNA元件。现有工具箱里的工具，已经不够用了。
面对这一挑战，研究团队展现了非凡的雄心和魄力。他们决定进行一次史无前例的大规模筛选。他们的逻辑非常清晰：病毒在亿万年的进化中，早已成为操纵宿主细胞机器的大师。为了让自己的RNA在宿主细胞内高效复制和表达，病毒的基因组中必然隐藏着大量巧妙的调控元件。这个病毒基因库，就是一个尚未被充分挖掘的“宝藏”。
第一阶段：锁定“高产”蛋白的病毒序列
研究人员构建了一个庞大的文库，包含了来自337种不同病毒的196,277个独特的基因片段。这些病毒涵盖了所有七种巴尔的摩病毒分类系统，确保了筛选的广度和深度。每一个片段长约197个核苷酸，它们被巧妙地插入到一个报告基因，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的3'UTR位置。
接下来，这个巨大的质粒文库被整合到人HEK293T细胞的基因组中，确保每个细胞只含有一个待测的病毒片段。然后，研究人员利用流式细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting, FACS），对数千万个细胞进行筛选。他们的目标非常明确：找到那些能让细胞发出最亮、最持久绿色荧光的病毒序列。这背后是对“增强蛋白表达”最直接的功能性筛选。经过两轮严苛的筛选，他们富集到了大约10,784个表现优异的“候选者”。
第二阶段：直击核心，检验RNA稳定性
仅仅蛋白表达量高还不够，研究的核心目标是找到能增强m1Ψ修饰mRNA稳定性的元件。于是，研究进入了更为关键的第二阶段。
研究人员将第一阶段筛选出的10,784个病毒片段，克隆到带有m1Ψ修饰的萤火虫荧光素酶（luciferase）报告mRNA的3'UTR。随后，他们利用LNP技术，将这个mRNA文库转染到人HCT116细胞中。在转染后的0小时和36小时，他们分别提取细胞中的总RNA，并通过高通量测序来定量每一种报告mRNA的丰度。
这个设计的巧妙之处在于，通过比较36小时和0小时的RNA丰度比值，可以直接衡量每个病毒元件对mRNA稳定性的贡献。如果一个元件能保护mRNA不被降解，那么在36小时后，含有该元件的mRNA的相对丰度就会更高。
测序结果令人振奋。数据显示，在近万个候选者中，有131个片段表现出显著增强m1Ψ修饰mRNA稳定性的能力。这些“优胜者”并非零散分布，而是形成了11个明显的簇，研究人员将它们命名为A1到A11。这场艰苦的“大海捞针”终于有了回报，他们找到了梦寐以求的、与化学修饰兼容的新型稳定元件。
找到了这些元件，下一个问题自然是：它们是如何施展“魔法”的？
研究人员的目光聚焦到了细胞内一种名为TENT4的酶上。TENT4是一种末端核苷酸转移酶，它的一个特殊功能是在mRNA转录后，为其poly(A)尾进行延伸。更有趣的是，TENT4添加的并不仅仅是腺苷酸（A），它还会掺入其他种类的核苷酸（如G, U, C），形成一条“混合尾”（mixed tail）。这条混合尾由于结构不纯，能更有效地抵抗去腺苷酸化复合物CCR4-NOT的降解，从而极大地增强mRNA的稳定性。这就像是为即将耗尽的“倒计时沙漏”重新添加沙子，甚至换上了更耐磨的“魔法沙粒”。
研究团队推测，A1-A11元件可能正是通过招募TENT4来实现其稳定功能的。为了验证这一假设，他们使用了一种名为RG7834的TENT4特异性抑制剂。结果是决定性的：在加入RG7834后，所有11个A元件的增强效果都消失了。这为它们的TENT4依赖性提供了有力的证据。
为了让证据更直观，他们使用了两种先进的技术来直接观察poly(A)尾的长度变化。Hire-PAT分析显示，不含A元件的对照mRNA，其poly(A)尾在12小时内迅速从最初的60个核苷酸（nt）缩短。而含有A2或A7元件的mRNA，其poly(A)尾不仅没有缩短，反而被显著延长了！纳米孔直接RNA测序（Nanopore direct RNA sequencing, DRS）技术提供了更惊人的细节。这项技术可以直接读取单个RNA分子的序列和电流信号。数据显示，在12小时后，对照mRNA的poly(A)尾中位长度缩短至38 nt；而含有A2和A7的mRNA，其尾长中位数分别达到了惊人的163 nt和91 nt。更重要的是，电流信号图谱清晰地显示，这些被延长的尾巴中，确实掺杂了大量非腺苷酸的核苷酸，这正是TENT4介导的“混合尾”的直接证据。
更有趣的是，这11个元件并非通过完全相同的机制招募TENT4。其中10个元件（除A7外）都含有一个保守的“CNGG”基序，它们依赖TENT4的一个已知辅助因子ZCCHC14来发挥作用。而明星分子A7，则是一个彻头彻尾的“异类”。它不包含CNGG基序，并且在敲除了ZCCHC14甚至另一个辅助因子ZCCHC2的细胞中，其功能完全不受影响。这表明，A7通过一种全新的、尚未被阐明的机制来招募TENT4，这让它显得更加独特和神秘。
在11位“优胜者”中，源自一种火鸡病毒（Melegrivirus A）的A7元件，凭借其卓越的性能和广泛的适用性，脱颖而出，成为了当之无愧的“主角”。
无视边界的普适性
研究人员在一系列严苛的测试中，检验了A7的“全能”属性：
跨越细胞类型：在包括肝细胞（HepG2）、肺上皮细胞（A549）、T细胞（Jurkat）在内的多种人类细胞系中，A7都表现出强大而稳定的活性。这预示着它在针对不同组织和疾病（如肝脏代谢疾病或T细胞免疫疗法）的治疗中具有巨大的潜力。
兼容多种修饰：除了与m1Ψ完美兼容，A7在与另一种常用化学修饰：5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m5C）联用时，依然能保持功能。
驾驭复杂分子环境：无论上游搭配哪种5'UTR，无论编码区编码的是短寿命的荧光蛋白（d2EGFP）还是膜蛋白（HA），甚至在面对经过高度密码子优化、RNA二级结构复杂的编码序列时，A7都能显著提升蛋白表达。这证明了它是一个即插即用的、高度模块化的强大工具。
A7 vs. 商业疫苗UTR vs. 环状RNA
口说无凭，实验为证。研究人员安排了一场“巅峰对决”，让A7直面现有的顶尖技术。
首先是与商业化疫苗3'UTR的比较。数据显示，在转染3天后，含有A7S（A7的一个优化短版本）的mRNA所产生的蛋白量，分别是含有mRNA-1273 UTR和BNT162b2 UTR的65倍和17倍。到第5天，这一差距进一步拉大到114倍和78倍。其优势之大，令人印象深刻。
接下来是与环状RNA的终极较量，这直接关系到A7能否解决“效率与稳定”的根本矛盾。研究人员同时比较了RNA半衰期（稳定性）和蛋白质总产量（效率）。
稳定性对决：在HepG2细胞中，A7S线性mRNA的半衰期为15.9小时，与环状RNA的15.1小时旗鼓相当，远超对照线性mRNA的6.0小时。在HCT116细胞中，A7S的半衰期更是达到了19.0小时，同样与环状RNA（19.5小时）不相上下。这场对决，A7在稳定性上与环状RNA打成了平手。
效率对决：这才是真正见证奇迹的时刻。尽管稳定性相似，但蛋白质的表达量却天差地别。在7天的时间里，通过计算总蛋白产量（曲线下面积,AUC），研究人员发现，A7S线性mRNA的总蛋白产量，在HepG2和HCT116细胞中，分别是环状RNA的5.3倍和5.8倍！
为什么会这样？答案在于翻译机制的根本不同。A7S线性mRNA保留了高效的“帽子依赖性”翻译途径，而环状RNA依赖的IRES途径效率要低得多。A7的出现，第一次让我们看到了一种可能性：我们可以同时拥有线性mRNA的高效率和环状RNA的长寿命。它解决了这个领域最核心的矛盾之一。
体外细胞实验的成功固然可喜，但真正的考验来自于复杂的体内环境。A7能否在活体动物中复制它的传奇表现？
研究团队将编码萤火虫荧光素酶的三种不同mRNA：对照线性mRNA、环状RNA和A7S线性mRNA，分别封装在LNP中，通过静脉注射到小鼠体内，并利用活体生物发光成像技术，实时追踪蛋白表达情况。
成像结果如同一部激动人心的纪录片，清晰地展示了A7的强大威力：
第一天：注射仅一天后，A7S组小鼠体内的荧光信号强度就已经是还对照组的约7倍，更是环状RNA组的108倍。
第三天：差异变得更加悬殊。A7S组的信号强度飙升至对照组的380倍，环状RNA组的688倍。环状RNA虽然稳定，但其极低的表达效率在体内被暴露无遗。
持久的续航：最关键的指标是“续航能力”。对照组的信号在几天内迅速衰减，而A7S组的信号则展现出惊人的持久性。荧光信号一直持续到了第13天，依然清晰可见。
最终的证据：在实验的第14天，研究人员解剖了小鼠，对器官进行离体成像。结果显示，A7S组小鼠的肝脏中，依然能检测到非常强烈的荧光信号。
这场在生命体中上演的“表达马拉松”，A7以绝对优势胜出。它不仅跑得快（表达水平高），而且跑得久（表达持续时间长），完美地证明了其作为新一代mRNA疗法核心元件的巨大潜力。
从一个关于化学修饰与稳定元件不兼容的意外发现，到一场遍历病毒世界的宏大筛选，再到精密的机制解析和最终令人信服的动物实验验证，这项研究为我们讲述了一个完整而精彩的科学故事。
A7元件的发现，其意义远不止于一个更优的分子工具。它可能从根本上改变mRNA疗法的应用版图。在此之前，对于需要长期稳定表达蛋白的疾病，如需要定期补充功能性蛋白的酶替代疗法，或者需要体内持续生产治疗性抗体的应用，线性mRNA因其“短命”的本质而显得力不从心。A7的出现，则为这些领域带来了曙光。它所代表的“高效+长效”线性mRNA平台，结合了现有技术的优点，同时规避了它们的缺点，为开发全新的RNA药物提供了坚实的基础。
这项研究也再次提醒我们，自然界，尤其是与我们共存了亿万年的病毒，是创新灵感的无尽源泉。通过向这些“分子大师”学习，我们能够找到解决复杂生物学问题的钥匙，推动医学不断向前发展。一个属于长效mRNA疗法的新时代，或许正由A7这样的“病毒密码”悄然开启。
参考文献
Jung SJ, Seo JJ, Lee S, Hyun SI, Lee JE, Lee S, Lee Y, Chang H, Lee H, Kim JH, Kim VN. RNA stability enhancers for durable base-modified mRNA therapeutics. Nat Biotechnol. 2025 Nov 7. doi: 10.1038/s41587-025-02891-7. Epub ahead of print. PMID: 41203992.
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来源：生物探索一点号1