摘要：各种亚细胞器在真核细胞中发挥着不同的细胞功能，对维持正常的生命活动至关重要。线粒体主要由核酸和蛋白质组成，可产生大量能量(三磷酸腺苷；ATP)，调节细胞代谢。此外，它们在细胞程序性死亡和钙稳态调节中发挥重要作用。核仁作为细胞内重要的亚核结构，是核糖体核糖核酸(

各种亚细胞器在真核细胞中发挥着不同的细胞功能，对维持正常的生命活动至关重要。线粒体主要由核酸和蛋白质组成，可产生大量能量(三磷酸腺苷；ATP)，调节细胞代谢。此外，它们在细胞程序性死亡和钙稳态调节中发挥重要作用。核仁作为细胞内重要的亚核结构，是核糖体核糖核酸(RNA)合成和加工的场所。 值得注意的是，作为进入和与核仁相互作用的屏障，核孔复合物(NPCs)通常会阻止材料(注定不会越过核封套)在活细胞中的渗透性，可以很好地解释为什么很少有可用的核仁探针被报道的原因。先前的研究表明，在特定的生理和病理情况下，线粒体和核仁的形态变化和相互作用总是动态变化的。它们的形状、大小、数量和微环境等特征是恶性病变演变的重要指标。 在这方面，实时监测线粒体和核仁的动态性和异质性，以协同指导具体的病理过程，将更准确地进行疾病诊断和治疗。尽管经过不懈努力，迄今为止，也只有很少的适合同时染色活细胞中两种亚细胞器的荧光探针。

荧光寿命成像显微术(FLIM)是一种在生命科学领域应用非常广泛的技术，它利用生物体内固有的生物分子的荧光或外源性荧光团实现高分辨率成像，与传统的基于强度的荧光成像不同，荧光寿命相对不受探针浓度、激发强度或光漂白变化的影响。除了简单的可视化，FLIM对局部微环境的变化高度敏感，如极性、粘度、离子强度和代谢物浓度，这可以揭示广泛的细胞内相互作用，涉及蛋白质、脂质、DNA和其他生物分子。FLIM通常通过时间相关的单光子计数在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM)中实现，提供纳秒级范围的荧光寿命值，能够在延长的成像时间内长期跟踪亚细胞器内的细微动态变化和异质性。值得注意的是，在氧化应激或细胞损伤等过程中，细胞器特异性微环境会伴随着寿命值的波动发生动态改变，这使得FLIM成为实时监测这些生物学变化的有价值的工具。然而，尽管已经取得了一些成果，在设计和合成具有优异环境敏感性和光稳定性的探针方面仍需要投入大量的精力。特别是能够通过FLIM可视化并区分线粒体和核仁的探针仍然稀缺。

研究者通过桥接工程开发了三个电子供体- π -电子受体( D-π-A )型超光稳定荧光探针(DM、DSM和DSSM)。通过在π桥中引入可变的噻吩单元(从1到2)，实现了分子扭曲和共轭长度的微调，实现了对生物分子的不同亲和力。其中，N，N-二甲氨基苯基作为荧光成像的D和发色团，带正电的吡啶盐部分作为A和靶向基团。令人鼓舞的是，体外和细胞实验表明，只有含有单个噻吩的DSM能够在响应RNA和蛋白质后同时成像线粒体和核仁。更重要的是，在DSM处理的HepG2细胞中，线粒体(τavg=1.197 ns)和核仁(τavg=2.259 ns)的空间分离被可视化，具有可区分的平均荧光寿命。然而，DSM允许实时跟踪线粒体和核仁的形态变化和功能障碍，特别是通过FLIM区分正常和肿瘤组织(Scheme 1b)，这在疾病诊断中表现出巨大的潜力。

分子设计与合成：D-π-A型分子由π桥连接的D和A单元组成，可以被广泛修饰以获得良好的光物理性质，用于细胞过程的实时成像。如图1a所示，3个D-π-A探针(DM，DSM和DSSM)是由N，N-二甲胺基苯基(D)与带正电荷的吡啶盐(A ,对带负电荷的RNA具有高亲和力)结合而设计的。为了研究D-π-A框架中π桥长度和类型对电子能级的影响，将一个或两个噻吩单元依次插入共轭的C-C连接体中，实现了对分子扭曲和共轭长度的精细控制。此外，加入转子状结构元件和靶向基序可以调节探针的亲脂性和亲电性特征，从而实现精确的亚细胞定位和对局部微环境变化的敏感性。 通过Suzuki偶联和Knoevenagel缩合反应合成了DM、DSM和DSSM，分离收率为40-70 % 。其结构经1H，13C NMR和高分辨质谱分析确证。

光物理性质：采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对DM、DSM和DSSM的光物理性质进行了系统研究。如图2a - c所示，它们分别在约450、460和470 nm处表现出逐渐红移的吸收峰，但在水溶液中的荧光发射较弱，不利于生物成像。令人鼓舞的是，具有单个噻吩单元的DSM显示出286 nm的超大斯托克斯位移，这使得光谱串扰最小，从而有效地抑制了来自生物自发荧光的干扰。 此外，浓度依赖的吸收光谱描绘了所有三个探针具有较大的摩尔消光系数( ε×104)和优越的光子捕获能力。然后，对基态和激发态进行了含时密度泛函理论(TD-DFT)计算，以阐明其潜在的光电机制。DM、DSM和DSSM的最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道(HOMO-LUMO)能隙(Eg)分别为2.68、2.53和2.51 eV，这与光谱学中的实验观察结果一致。这个发现突出了DSM在后续亚细胞器成像和实时追踪动态细胞过程方面的潜力。

RNA与蛋白的结合能力：RNA以单股螺旋的方式组装成核苷酸链，主要存在于线粒体和核仁中。考虑到带正电荷的荧光团很容易通过静电作用与带负电荷的RNA30结合，首先通过光谱仪器评估了DM、DSM和DSSM对RNA的一系列荧光响应实验。如图2d和S12所示，在460 nm光激发下，当滴定RNA从0到30μL时，DSM(10 μM)在520 nm附近的荧光信号增加最多(8倍)，DM(5倍)和DSSM(6倍)次之，表明RNA对DSM的亲和力最强。 然后，计算RNA浓度与荧光强度之间的线性关系(图2e )，检测下限(LOD)为2.15 μg/mL。此外，由于蛋白质通常是线粒体的另一个重要组成部分，因此进行了探针与牛血清白蛋白(BSA)之间的荧光滴定实验。在相同的激发条件下，只有当DSM(10μM)与BSA(0~30μL)混合时，在660 nm附近获得了相似的荧光响应，LOD为2.09 μg/mL，远小于已报道的指标。

细胞是复杂的生物系统，包括各种微环境和生物成分。为了评估所制备探针的抗干扰能力，DM、DSM和DSSM在不同溶剂(从低极性丙酮到高极性H2O)和pH值5.0~9.0范围内的一系列荧光发射行为依次进行了考察。3个探针均表现出微弱的荧光发射，且对溶剂极性或pH的依赖性较小。仔细获取了含有代表性阳离子、阴离子、氨基酸和蛋白质的各种物质进行验证。图2h中的荧光信号验证了只有DSM可以高灵敏的选择性响应RNA和蛋白质。 这将使DSM成为同时追踪线粒体和核仁动态变化的理想候选者。

深入了解DSM与RNA/Protein之间的相互作用机制：进行了圆二色谱(CD)滴定实验，以阐明DSM、RNA和蛋白质之间的结合相互作用。如图3a所示，RNA表现出特征的CD光谱，在270 nm附近有一个正带，在240 nm附近有一个负带，与核酸的A-形式构象一致。加入DSM后，在CD信号中观察到一定的干扰，表明带正电荷的DSM在带负电荷的RNA附近积累。值得注意的是，在450 nm区域出现了一个诱导的CD信号，与DSM的吸收带重合，其强度以浓度依赖的方式增加。这种负号通常表明RNA骨架参与的插入式结合模式。同时，BSA单独呈现典型的α螺旋CD特征，以208和222 nm为中心的两个负带为特征。随着DSM浓度的增加(0~25 μL)，光谱形状和峰位基本保持不变，仅有轻微的强度变化(图3b)，表明BSA与DSM相互作用后二级结构得以保留。在CD信号中观察到扰动，表明带正电荷的DSM在带负电荷的RNA附近积累。值得注意的是，在450 nm区域出现了一个诱导的CD信号，与DSM的吸收带重合，其强度以浓度依赖的方式增加。这种负号通常表明RNA骨架参与的插入式结合模式。同时，BSA单独呈现典型的α螺旋CD特征，以208和222 nm为中心的两个负带为特征。随着DSM浓度的增加(0~25 μL)，光谱形状和峰位基本保持不变，仅有轻微的强度变化(图3b)，表明BSA的二级结构在与DSM相互作用后得以保留。

此外，通过1H NMR滴定实验研究了DSM与生物分子之间的相互作用。如图2c所示，随着RNA(D2O-d2 0~30μL，10 mg/mL)浓度的增加，DSM (10 μM)的滴定导致吡啶盐环上的芳香质子信号(HA、HC)的高磁场位移约为0.08~0.11 ppm。这种位移可能归因于π-π堆积作用，其中增加的电子密度可能与氢轨道重叠，从而降低它们的振动自由度。鉴于DSM带正电荷与RNA带负电荷的的性质，静电相互作用也可能有助于结合过程。相比之下，逐渐加入BSA(D2O-d2 0~30 μL，10 mg/mL)，在DSM的苯环(HD)、噻吩环(HE)和乙烯基桥(HB, HB′)上观察到了低磁场位移为0.025~0.05 ppm的质子信号，表明DSM与BSA之间存在弱的非共价相互作用。为了进一步确定其在BSA中的特异性结合位点，使用位点I的标记物华法林进行了竞争结合实验。华法林的加入导致DSM/BSA复合物在662 nm处的荧光发射显著降低，表明DSM主要结合在BSA的亚结构域IIA (site I)上。

分别在291K和301K下，采用荧光滴定法研究了DSM与RNA和BSA之间的温度依赖结合常数(K)。根据Benesi−Hildebran方程计算结合常数，其值为3.217×107 M-1和0.217×107 M-1。值得注意的是，负的吉布斯自由能值(ΔG=-41.331 kJ·mol-1(RNA)和-35.254kJ·mol-1(BSA)表明它们具有高亲和力的自发结合过程。此外，DSM/BSA相互作用的焓变(ΔH)和熵变(ΔS)均为正值，表明DSM/BSA之间的疏水结合机制占主导地位。尽管如此，甘油作为一种高粘度的溶剂被用来模拟蛋白质的疏水微环境。DSM在660 nm处的荧光强度随着甘油含量(0和100%)的增加而显著增强，与BSA滴定结果一致。这些互补的光谱和热力学分析表明，DSM对RNA具有很强的亲和力，主要通过静电相互作用，而其与蛋白质(如BSA)的结合主要由疏水作用力驱动，而不会显著干扰蛋白质的二级结构。

特异性靶向线粒体和核仁：为了研究DSM的亚细胞定位，在DSM处理的HepG2细胞中进行了CLSM。如图4a，b所述，在460 nm激发下，荧光发射可以在以下两个通道中收集：绿色通道(500~600 nm )和红色通道(600~700 nm )，这分别与DSM对RNA和BSA的体外光谱响应很好地吻合。值得注意的是，在绿色通道中观察到围绕在细胞外周的丝状结构和细胞核内的球形结构，而红色通道显示荧光主要局限于外周丝状结构。合并的图像显示在细胞质的丝状区域有明显重叠的黄色荧光。考虑到不同亚细胞器的微环境不同，FLIM被用来提供进一步的洞察，并根据平均寿命的差异来区分这些亚细胞器。如图4c所示，在相同的激发下，通过指数拟合得到伪彩色图像，通过FLIM显示出两个不同的区域。一个区域主要定位于细胞质(感兴趣区域, ROI I)，其平均寿命集中在1.197 ns左右，介于DSM与RNA(τavg=2.277 ns)和蛋白质体外(τavg=0.907 ns)结合的寿命之间。 第二个区域主要分布在核区域( ROI II )，寿命显著延长，约为2.259 ns，与DSM与RNA (τavg=2.277 ns)结合时的荧光寿命非常匹配。

随后，使用市售细胞器特异性染料，包括Mito-Tracker Deep Red (线粒体)和Syto 9 (对于核酸/核仁)，进行了一系列共定位实验。以短波长发射通道为例，来自球形结构的绿色荧光与Syto 9的红色荧光紧密重叠。同时，丝状绿色结构与Mito-Tracker Deep Red (图4e , f)有较强的共定位。这些结果共同表明DSM能够同时显示活细胞内的线粒体和核仁。此外，由于DSM在上述不同的细胞器环境中具有明显的平均荧光寿命，因此，DSM可以作为一种有前途的指标来跟踪在各种生理和病理条件下(如炎症或肿瘤)线粒体和核仁的形态和环境变化。

用于长时间荧光成像的超光稳DSM：指示剂优越的光稳定性和低细胞毒性对于长时间的亚细胞器动态跟踪至关重要。为此，对DSM的光稳定性进行了初步评价。如图5a所示，在连续光照射下，用DSM标记的HepG2细胞分别用CLSM和FLIM成像。连续采集50帧后，DSM荧光强度下降幅度小于10% (图5b)，表明其具有优异的抗光漂白性能。这一观察也得到了体外光稳定性实验的支持，其中DSM在水溶液中的吸光度在连续光照下的降解率保持最低。此外，使用标准MTT法进行的细胞暗毒性测试显示，对细胞活性的影响可以忽略不计，证实了其在活细胞成像应用中的生物相容性。图5a、c的FLIM分析显示，线粒体(τavg=1.219~1.232 ns)和核仁的荧光寿命和形态仅有微小波动(τavg=2.183–2.251 ns )，表明在较长的观测时间内，DSM不会干扰细胞稳态。此外，为了评估潜在的光毒性，计算了DSM的单线态-三线态能级差(ΔEst)。较大的ΔEst值为1.59 eV(图5d)，表明在光激发下活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的概率较低，这是成像过程中光损伤最小化的重要因素。

实时Flim成像线粒体和核仁的动态变化: 为了深入了解线粒体和核仁是如何调控细胞生长和分裂的，我们利用DSM研究了生理条件下线粒体和核仁的动态变化。HepG2细胞用DSM染色20 min后，立即进行FLIM成像观察。如图6a、c所示，线粒体(τavg=1.211 ns)和核仁(τavg=2.249 ns)中不同的荧光寿命归因于它们不同的微环境和功能。此外，DSM实现了基于形态学特征的细胞伪足可视化。在选定的感兴趣区域(ROI-1和ROI-2，图6b)的Timelapse成像显示了细微的寿命变化和显著的形态学动态，特别是线粒体。例如，在ROI-1中，一个时间分辨的序列捕获了线粒体分裂和融合的完整周期。最初，在第一个18 s的(1→2)内，一个伸长的线粒体(≤2.5 μm)发生分裂，形成两个较小的线粒体(分别为1.7和0.8 μm)。在接下来的24 s (3→4 ,在42 s时)中，这些片段表现出快速的移动，最终导致了一个融合事件，重组了一个丝状线粒体(≤2.5 μm)。有趣的是，长时间观察(5→6)，在78 s时发现了随后的形态转变，先前融合的线粒体在两侧变得凹凸不平，最终再次分裂为两个不对称的线粒体片段(7→8 , 114 s)。 分裂和融合事件的持续时间约为30 s，表明在正常生理条件下，线粒体重构是一个动态和平衡的过程。

同样，在ROI-2区域内实时观察到动态的线粒体过程。如图6b、c所示，所选线粒体在大约2 min (1~8)内呈现出连续的"run-kiss-run-kiss-and-run"序列，反映了线粒体网络的动态重塑。这一现象与之前关于线粒体动力学的报道相吻合，在此过程中会发生一系列的生命活动，如清除受损的线粒体，调节ATP合成效率，恢复线粒体合成效率，恢复线粒体功能等。与线粒体形态的快速变化形成鲜明对比的是，核仁区域具有较长的荧光寿命，在室温下的相同观察时间内，其位置和形状基本保持不变。这种稳定性表明，在正常细胞条件下，核仁处于相对静止的状态。总之，这些发现突出了FLIM在实时可视化线粒体和核苷酸动态方面的应用，为细胞代谢、生物能量学和压力适应机制提供了有价值的见解。

氧化损伤过程中线粒体和核仁异质性的追踪: 正常情况下，细胞会自发产生ROS作为正常代谢过程的副产物。例如，线粒体电子传递链的电子泄漏会通过与分子氧的反应导致超氧阴离子的形成。机制研究表明，升高的ROS水平可能诱导氧化应激，从而导致RNA和蛋白质等关键生物分子的损伤。这种氧化失衡可能会破坏细胞稳态，损害正常的细胞功能。作为概念的证明，通过使用共聚焦和FLIM分别实时监测荧光和寿命变化，研究了过量ROS对线粒体和核仁的影响。 首先，给予佛波酯12 -肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 (PMA)刺激内源性过氧化氢(H2O2)的产生，从而模拟细胞氧化应激条件。如图7a所示，在460 nm激发下，早在1min就观察到线粒体片段化，这可能是由于融合和分裂之间的平衡被打破。FLIM成像基于线粒体和核仁各自的平均荧光寿命(1.123 ns和2.276 ns)，清晰地区分了DSM标记的线粒体和核仁。随着孵育时间的延长，共聚焦成像模式捕获的绿色荧光显示出显著的降低(图7b)。具体来说，在25分钟的孵育过程中，线粒体区域的荧光衰减明显快于核仁区域，这表明线粒体对氧化应激的敏感性增强。这被JC - 10实验证实，在这些条件下，线粒体膜电位下降。为了更深入地了解亚器官氧化损伤过程中的微环境变化，进行了延时FLIM成像。在通道I中，线粒体的平均荧光寿命从1.123~0.776 ns，并伴随着从短杆状结构到分散的点状结构的形态变化。相反，通道Ⅱ显示核仁荧光寿命从2.276~2.701 ns，经相量图分析(图7c , d)验证，可能与染色质凝聚有关。

肿瘤等疾病的发生往往伴随着急性炎症反应和ROS的过量产生。因此，实时跟踪线粒体和核仁的异质性可以作为肿瘤有价值的诊断标志物，强调早期发现和及时干预的重要性。首先，通过皮下注射H22细胞(108个/mL)建立H22荷瘤小鼠模型，然后使用DSM在厚组织水平(100~200 μm )进行成像，如图7e所示。在460 nm激发下，Z-Stack扫描结果显示，肿瘤组织中可发现比正常组织更多荧光信号减弱的空腔。通过计算，荧光信号下降约71%，可用于对病变的发生做出初步评估(图7f)。具体来说，荧光寿命的伪彩色图像与正常组织相比也呈现出明显的区别，与细胞水平上的现象保持一致，进一步证明了其诊断肿瘤发生的潜力。

综上所述，具有特异性RNA和蛋白质靶向能力的荧光生物探针DSM可以很容易地穿透NPCs同时成像线粒体和核仁。令人鼓舞的是，DSM表现出优异的综合性能，包括灵敏的荧光响应、大的斯托克斯位移(286 nm )、优异的光稳定性和低细胞毒性。正如预期的那样，通过FLIM可以实时可视化和动态跟踪特定生理和病理情况下线粒体和核仁的形态变化和异质性。具体来说，在正常生理条件下，DSM可以动态监测线粒体分裂和融合，指示细胞的生命活动。 然而，在氧化损伤状态下，它也可以显示线粒体功能障碍，寿命(从1.123~0.776 ns)减少，染色质浓缩，寿命(从2.276~2.701 ns)增加。尽管如此，在肿瘤中发现了比正常组织多得多的新鲜厚组织的Z-Stack扫描，以及可变的荧光寿命，进一步证明了诊断肿瘤发生的潜力。

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来源：凯视迈精密测量