摘要：患者来源的类器官（PDO）是精准肿瘤学中强有力的临床前模型。然而，目前大多数现有方案依赖于手术切除标本，这限制了它们在不适合手术的患者中的应用。

患者来源的类器官（PDO）是精准肿瘤学中强有力的临床前模型。然而，目前大多数现有方案依赖于手术切除标本，这限制了它们在不适合手术的患者中的应用。

该研究提出了一种从多种临床可获取标本（包括活检样本——如内镜超声引导下细针穿刺活检[EUS-FNB]、经皮肝穿刺活检[PLB]、腹水及胸腔积液）中生成PDO的通用方案，适用于多种癌症类型。

详细描述了标本运输、肿瘤细胞分离、培养、生物样本库建立以及高通量药物筛选等步骤，从而支持PDO在不同临床环境下转化研究中的可重复应用。

文章介绍

题目：多模态标本来源类器官的生成与利用方案

杂志：STAR Protocols

影响因子：1.3

发表时间：2025年9月

#1

研究背景

Background

该方案为从多种临床样本（包括手术切除组织、EUS-FNB、PLB、打孔活检以及液体活检样本[如恶性腹水或胸腔积液]）中建立PDO提供了一种稳健且灵活的方法。

高效的组织解离是成功建立PDO的关键步骤。此方案中，手术样本使用了肿瘤解离酶试剂盒，并结合gentleMACS Octo解离器（带加热功能）。这种配置能够在受控温度条件下实现标准化的机械和酶解离，具有高度的可重复性和高通量性——这在处理大量样本的生物样本库环境中尤其有益。

不过，使用gentleMACS设备并非强制要求。在没有该仪器的实验室中，可以使用标准振荡培养箱进行酶消化。也可以用更常见的解离酶（如胶原酶和/或分散酶）替代解离酶试剂盒。对于活检样本或液体样本等小体积标本，手动机械解离（例如轻柔吹打或敲击）结合37°C下的酶孵育就足够了，而且通常更为可取。

该方案考虑到了低输入量样本的特殊处理需求，并针对实体瘤和液体瘤来源均进行了优化。即使对于晚期或无法手术的患者，从液体活检中生成类器官也使得功能研究成为可能。

通过从大量不同临床样本中获得的实践经验进行的优化，该方案为在各种研究和临床环境中建立PDO提供了一个可重复且易于实施的基础。

#2

研究关键

Key

实验设计

实验方案示意图

实验步骤

（一）类器官培养试剂制备

1. 组织转移培养基的制备 ● 时间 10 min

a. 取50 mL无血清RPMI 1640培养基。

b. 加入100 μL 500×原霉素（50 mg/mL）。

c. 充分混匀溶液。

d. 将4 mL混合液分装至每个5.0 mL的Eppendorf管中。

e. 将分装好的溶液在4°C下保存，最长可保存2周。

2. 肿瘤组织解离酶的制备（用于细胞分离） ● 时间 30 min

▲关键：按照制造商的指南进行人肿瘤解离试剂盒的配制和储存。确保所有酶分装液避免冻融循环。所有分装液应储存在避光棕色管中。

a. 复溶酶H

i. 向每支含冻干酶H的小瓶中加入3 mL无血清RPMI 1640培养基。

ii. 通过轻柔移液或倒置方式充分混匀每支小瓶。

iii. 将每份溶液经0.2 μm注射器式滤器过滤。

iv. 每管分装200 μL。

b. 复溶酶R

i. 向含冻干酶R的小瓶中加入2.7 mL无血清RPMI 1640培养基。

ii. 充分混匀后，每管分装100 μL。

c. 复溶酶A

i. 向含冻干酶A的小瓶中加入1 mL缓冲液A（试剂盒提供）。

ii. 每管分装30 μL。

d. 将所有酶分装液储存于−20°C。复溶后的酶在6个月内保持稳定。

3. 制备类器官生长培养基 ● 时间 30 min

▲关键：类器官生长培养基应根据每种癌症类型进行定制，通过添加促进类器官生成和增殖的特定生长因子，以反映各类肿瘤独特的微环境因素。本方案基于先前已发表的研究，提供了六种癌症类型的优化培养基配方，这些癌症类型均已成功建立并扩增为类器官。此外，该方案可根据需要调整培养基成分，适用于其他癌症类型。

a. 将所有储存于−20°C的组分原液解冻。

注意：原液按指定浓度配制，经无菌过滤、分装后储存于−20°C。

b. 照“材料与设备”部分表格中列出的成分，制备500 mL人肿瘤类器官基础培养基。

c. 将类器官基础培养基分装为50 mL每份。

d.向基础培养基中添加肿瘤类型特异性补充剂，制备最终的类器官生长培养基。

4. 准备50 mL类器官冷冻培养基。

a. 胎牛血清（FBS）热灭活处理 ● 时间 1 h

i.将FBS置于60°C水浴中孵育30 min以进行热灭活。

注意：孵育期间每5–10 min轻轻混匀一次，确保受热均匀。

ii. 冷却至20°C–25°C后，在无菌条件下使用0.2 μm瓶顶滤器过滤热灭活的FBS。

iii. 将FBS分装至45 mL无菌锥形管中，储存于−20°C。

b. 取出储存于−20°C的45 mL热灭活FBS分装管，在4°C下缓慢解冻。● 时间 4–6 h

c. 使用连接电动移液辅助器的血清移液管，加入5 mL DMSO。

d. 加入500 μL 100× Y-27632（ROCK抑制剂），充分混匀后，储存于4°C（可保存长达1个月）。● 时间 10 min

5. 配制500 mL 0.1% BSA-PBS溶液 ● 时间 30 min

a. 将0.5 g牛血清白蛋白（BSA）加入500 mL经高压灭菌制备的1×无菌PBS缓冲液中；

b. 持续搅拌直至溶液完全均匀；

c. 使用0.2 μm孔径的瓶顶真空过滤系统对溶液进行过滤除菌；

d. 将每份溶液分装50 mL至50 mL锥形管中，于4°C避光保存（有效期不超过1个月）。

6. 分装基底膜提取物（BME）。

a. 将5 mL BME在0–4°C下逐渐解冻，直至完全液化。

b. 将解冻的BME分装为1 mL/管，装入1.7 mL离心管中。

c. 将需要立即使用的量储存在4°C，其余分装管放回−20°C保存以备后用。

（二）分步操作方法详情

A 从手术组织中建立类器官

● 时间 样本处理20 min；组织解离与类器官接种1.5 h；3D液滴固化30 min

本步骤描述了采集患者来源的肿瘤组织、分离肿瘤细胞并建立类器官的过程（图1A）。将肿瘤组织切割成若干约0.5×0.5 cm的立方体块，其中一块用于类器官培养，其余保存用于基因组学、蛋白质组学及其他后续分析。

图1. 建立PDO的标本处理详细步骤示意图。(A) 收集的手术切除组织标本通过切碎处理，随后进行酶解和机械解离。(B) 收集的活检标本使用无菌剪刀切碎，随后进行酶解和孵育。(C) 液体活检标本通过密度梯度离心法处理，以分离单核细胞。

▲关键：获取肿瘤组织后，必须防止任何外部污染。此外，肿瘤细胞比例及肿瘤微环境构成是决定类器官建立成功与否的关键因素。高免疫细胞/基质细胞含量与低肿瘤细胞占比会显著降低培养成功率。

1. 切除肿瘤组织的采集与初步处理

▲关键：若组织标本可在接收后2-4 h内进行处理，请使用转移培养基进行采集；如储存时间超过4 h，则需采用Miltenyi公司的MACS组织保存液进行标本采集与保存。

a. 在冷藏箱中备好分装好的转移培养基、已灭菌的镊子、手术刀片及冰块，用于标本运输。

b. 立即将手术切除的组织放入含有转移培养基的5 mL Eppendorf管中，并置于冰上保存。

c. 使用无菌镊子将组织标本放置于培养皿上，评估其性状与硬度。

d. 去除非肿瘤成分（如脂肪、上皮或肌肉组织），仅保留含肿瘤的区域（图2A）。

e. 将肿瘤部分切割成0.5×0.5 cm的小块（图2B）。

图2. 手术切除组织标本的处理流程以建立PDO。

2. 组织解离以分离肿瘤细胞

▲关键：本方案采用美天旎（Miltenyi）公司GentleMACS Octo自动组织解离系统进行自动化组织解离。

a. 从−20°C冰箱中各取出一管肿瘤解离酶H、R和A，在4°C下解冻。

b. 将一块肿瘤组织置于预先加入100 μL无血清RPMI 1640培养基的培养皿中，使用手术刀片（Feather，货号HFE-SB21）将组织切碎，直至其质地呈糊状（图2C）。

▲关键：充分切碎可增加酶的作用表面积，提高细胞得率。需持续切碎直至组织呈现糊状。

c. 打开GentleMACS C管的盖子，小心地将装有切碎组织的培养皿倾斜，使组织靠近管口。

d. 使用5 mL血清学移液管，以适当力度吸取4.5 mL无血清RPMI培养基，轻柔地将组织推入GentleMACS C管中。

▲关键：切勿反复吹打组织，以免组织黏附在移液管上，降低细胞回收率。应利用培养基的流动轻柔地将组织推入管内。

e. 向C管中加入200 μL酶H、100 μL酶R和25 μL酶A。

f. 拧紧螺旋盖，将C管垂直安装到GentleMACS Octo自动组织解离系统上，盖子朝下。随后将加热模块置于其上方。

g. 运行“37C_h_TDK_3”程序。

▲关键：应根据步骤1-c中观察到的组织硬度以及不同肿瘤类型的特性（见表1），选择合适的GentleMACS Octo自动组织解离系统程序。

▲关键：所配加热模块用于维持37°C孵育温度，而C管转子的旋转则促进物理解离过程。

h. 40 min后，终止程序并将C管从设备上取下。

▲关键：如果在C管中观察到组织未充分解离，请将样本再孵育10 min。但总孵育时间不得超过1 h。延长孵育时间不会增强纤维组织或结缔组织的解离效果，且可能损伤肿瘤细胞。因此，是否继续孵育必须根据组织的物理特性谨慎判断。

i. 将C管中的细胞悬液转移至15 mL离心管中。

▲关键：使用血清学移液管转移细胞悬液时，细胞或组织可能附着于管壁表面，导致损失。因此，建议直接倾倒悬液至离心管中。

▲关键：为提高肿瘤类器官建立的成功率，请勿使用滤网，以避免截留在组织碎片间的肿瘤细胞丢失（图3）。

图3. 基质组织内生成的类器官景观。（A）酶解与机械解离后纤维成分与分散肿瘤细胞的显微图像。（B）基质组织内生长的肿瘤类器官示例。省略过滤步骤可使嵌入基质组织中的肿瘤细胞形成类器官，从而最大限度减少有限患者样本的细胞损失。白色箭头指示类器官；黑色箭头指示基质组织。

j. 向原C管中加入5 mL无血清RPMI 1640培养基，盖紧管盖并轻轻摇晃，以收集残留细胞。

k. 打开C管，将其内容物倒入含有初始悬液的15 mL离心管中。

▲关键：操作需尽可能迅速完成。常规使用含FBS的培养基来灭活解离酶；但本方案的目的是在无FBS环境下生成类器官。

l. 室温下以360×g离心细胞悬液5 min。

m. 吸弃上清液，使用5 mL血清学移液管加入5 mL PBS洗涤细胞沉淀。

n. 再次在25°C、360×g条件下离心5 min，随后吸弃上清液。

可选步骤：若肉眼观察到红细胞（RBC）约占细胞沉淀总体积的50%，则进行红细胞裂解处理。

i. 向含有沉淀的15 mL离心管中加入1 mL 1×红细胞裂解缓冲液。

ii. 轻轻敲击重悬沉淀，随后室温孵育1 min。

▲关键：初始溶液呈红色浑浊状；孵育后变为红色澄清状。

▲关键：若红细胞较多，可适当延长孵育时间。但需谨慎，因长时间孵育可能损伤肿瘤细胞。推荐最长不超过10 min。

iii. 使用10 mL血清学移液管加入9 mL PBS稀释红细胞裂解缓冲液。

iv. 在25°C、360×g条件下离心5 min。

o. 使用1000 μL移液枪头吸取1 mL PBS重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至1.7 mL Eppendorf管中。

3. 细胞计数及三维培养接种

a. 将10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合。

b. 取10 μL混合液加载至兼容自动细胞计数仪的计数载玻片上。

c. 进行细胞计数。

d. 确定接种液滴数量并计算所需BME体积。

▲关键：当实现单细胞解离时，每24孔板中的一个穹顶接种1×10⁵个细胞于40 μL BME中。但由于通常无法完全解离，沉淀体积可能大于计数的细胞数。此时可根据沉淀体积估算需接种的穹顶数量。例如，约0.5×0.5 cm的肿瘤组织通常可制备用于接种24孔板4个孔的材料。此非固定规则，应根据组织成分和解离效率调整。

可选操作：若获得足够细胞以接种六个或更多穹顶，剩余细胞可用冷冻培养基冻存备用。

e. 将BME分装小份置于冰上。

f. 在室温下以360×g离心力离心1.7 mL Eppendorf管中的细胞悬液5 min。

g. 使用1000 μL移液枪头彻底吸除上清液。

h. 缓慢谨慎地用计算所得体积的BME重悬细胞沉淀。

i. 在24孔板每个孔的中心放置40 μL BME-细胞悬液液滴。

▲关键：若存在部分未解离的组织，可用无菌剪刀修剪移液枪头尖端以便液滴接种。

▲关键：在三维穹顶结构中残留的气泡可能会影响结构完整性，并在添加培养基后的孵育过程中导致穹顶坍塌。为避免这种情况，请缓慢、小心地吸取BME，因为其具有高粘性。虽然小气泡通常不会造成问题，但如果形成大气泡（宏观气泡），应在穹顶形成后，立即使用连接移液器的10 μL或200 μL移液器吸头将其吸除。此步骤必须在穹顶固化之前完成。

j. 在显微镜下观察已接种细胞的3D穹顶整体形态（图4）。

图4. 基质胶（BME）中肿瘤细胞与基质细胞分布的显微镜观察图。

k. 将24孔板置于37°C和5% CO₂条件下孵育30 min以使其固化。

l. 每孔加入500 μL预热过的类器官生长培养基。

▲关键：为避免破坏已固化的BME穹顶，请沿孔壁缓慢加入培养基。

m. 将培养板置于37°C和5% CO₂条件下继续孵育。

B. 从活检组织（EUS-FNB、PLB及打孔活检）建立类器官

● 时间 类器官接种1 h；3D液滴固化30 min

本步骤描述了如何从EUS-FNB、PLB和打孔活检标本中生成类器官，这些标本主要采集自无法手术的转移性或局部晚期组织（图1B）。

▲关键：EUS-FNB标本通常包含较小且较软的组织碎片，红细胞（RBC）含量往往较高。相反，PLB和打孔活检标本一般通过相对较大的穿刺针经皮肤获取，因此得到的组织块较大且密度更高。应根据这些组织特性相应调整实验方案。

4. 活检组织的收集

a. 在冷藏箱中准备转移培养基分装液和冰块，用于标本运输。

b. 立即将活检标本放入含有转移培养基的5 mL Eppendorf管中，并置于冰上。

5. 活检组织解离以分离肿瘤细胞

a. 清洗组织

i. 将试管放在试管架上，静置5 min，使组织在重力作用下沉降。

ii. 当组织沉至管底后，使用1000 μL移液器吸除上清液。

iii. 加入2 mL含有100 μg/mL原霉素的新鲜转移培养基。

iv. 重复步骤i–iii两次。

▲关键：如果组织已经分散且不再保持原有形态，可通过360×g离心5 min进行收集。

b. 使用无菌镊子将样本转移至含有1 mL无血清RPMI培养基的1.7 mL Protein LoBind管中。

c. 使用无菌剪刀（Kasco，货号5-005）在管内剪碎组织。

d. 将每种肿瘤解离酶小瓶在冰上解冻。

e. 向管中加入40 μL酶H、20 μL酶R和5 μL酶A。

可选：如果剪碎后组织高度粘稠，可加入1 μL DNase I以减少基因组DNA含量。

f. 将试管在37°C下旋转孵育15 min。

▲关键：如果没有带温度控制的旋转器，可在37°C下静态孵育，并每5 min轻敲一次。

g. 再次在室温下以360×g离心5 min，然后去除上清液。

可选：如果红细胞明显占据细胞团块总体积的约50%，则进行红细胞裂解。

i. 向含有细胞团块的1.7 mL Eppendorf管中加入1 mL 1×红细胞裂解缓冲液。

ii. 轻轻通过轻敲重悬细胞团块，然后在室温下孵育1 min。

▲关键：根据需要调整孵育时间，以确保溶液变得透明，如步骤2-n-ii所示。

iii. 在25°C下以7,500×g离心1 min。

iv. 去除上清液，并用1 mL PBS重悬细胞团块。

v. 重复步骤iii和iv。

6. 细胞计数及用于3D培养的接种

a. 返回步骤3并按所述方法继续操作。

C. 从液体活检标本（腹水/胸腔积液）中建立类器官

● 时间 类器官接种 1.5 h；3D液滴固化30 min

本节描述了利用腹水和胸腔积液标本中的肿瘤细胞建立类器官的操作流程。该过程的关键步骤是通过密度梯度离心法分离含有肿瘤细胞的单核细胞层（图1C和图5）。

图5. 从液体活检标本中分离肿瘤细胞的过程。

7. 收集液体活检标本

a. 通过经皮穿刺引流（图5A），从患者体内采集腹水或胸腔积液标本。

b. 将采集到的标本（50–100 mL）在无菌条件下于4°C保存，直至后续操作。

8. 从标本中分离肿瘤细胞

a. 将采集到的标本转移至一个50 mL离心管中（图5B）。

b. 在25°C下以400×g离心10 min。

c. 向一个新的15 mL离心管中加入7 mL Ficoll-Paque分离液。

d. 离心完成后，检查沉淀物的量，并吸弃上清液。

e. 轻轻轻敲细胞沉淀，加入7 mL无血清RPMI培养基使其充分重悬。

f. 使用血清学移液管（图5C），将细胞重悬液逐滴缓慢加到15 mL离心管中的Ficoll-Paque分离液上层（即步骤8-c）。

▲关键：操作要缓慢，以避免各层混合。

g. 将离心机制动级别设为5，在25°C下以400×g离心30 min。

▲关键：快速减速会扰乱分层效果，因此必须采用慢速制动。

▲关键：离心后应出现四层。其中第二层（图5D）包含单核细胞，包括肿瘤细胞。

h. 吸弃上层培养基，保留约1 mL。

i. 将巴氏吸管连接到移液辅助器上，小心地将单核细胞层转移至一个50 mL离心管中（图5E）。

▲关键：如果同时吸入了少量其他层的溶液也是可以接受的，优先考虑尽可能多地收集细胞。

j. 通过向50 mL离心管中加入无血清RPMI 1640培养基来清洗细胞，加入量至少为所收集细胞悬液体积的三倍（图5F）。

9. 细胞计数及用于3D培养的接种

a. 按照步骤2-l至3的方法继续操作（见图5G和H）。

▲关键：与实体组织标本相比，液体活检样本通常含有更高比例的免疫细胞。如果不进行红细胞裂解处理，总细胞计数可能会被高估。因此，在进行细胞计数时，应将自动化计数仪的阈值设置为仅包含大于9 μm的细胞，并使用这一经过调整的计数结果来确定待接种的液滴数量。

D 监测类器官形成情况并评估其形态 ● 时间 20 min

本流程阐述了如何评估类器官构建是否成功，并依据观察到的形态特征确定传代时机。

10. 类器官观察

a.在接种后的第一天起，每隔1-2天使用显微镜观察类器官。

▲关键：从接种后的第一天开始，应仔细监测以下情况：类器官是否形成、是否存在污染、细胞分布情况、是否存在基质成分以及BME穹顶的稳定性（例如是否塌陷、破裂、与培养板分离）。将每日观察结果和显著特征记录在日志表上，以便在构建失败时进行故障排查。为了监测生长情况，使用蔡司显微镜以明场模式在10×、20×和40×放大倍数下对类器官拍照，接种后每周至少拍摄两次。

b. 挑选达到合适状态、适合传代的类器官。

▲关键：在稳定后，早期类器官（p.1-4）和晚期类器官（>p.5）的传代所需时间可能有所不同。

i. 监测类器官的生长速率和密度。

▲关键：早期传代时，低密度或无生长迹象可能意味着构建失败（图6A-6E）。应观察到类器官的形成和生长，这表明构建成功（图6F-6J）。

图6. PDO构建尝试中生长失败或成功的评估。

▲关键：在早期传代时，可能需要长达1个月的观察时间才能确定构建是否成功。

▲关键：如果由于存在大量组织导致基底膜液滴塌陷，请按照步骤12所述程序立即进行传代，并监测类器官的形成情况。

ii. 稳定的类器官细胞系可以在传代前培养7-14天（图7）。

图7. 适用于传代的类器官代表性图像。确定传代时间是维持类器官特性及实现长期培养扩增的关键。传代周期因肿瘤类型和类器官的形态学特征而异，需综合考虑类器官的直径与密度等因素。

▲关键：确定传代时机的标准基于类器官直径（通过蔡司显微镜图像中的比例尺估算）和视觉密度（定义为视野覆盖率约为50%，图7）。这些参数可能因类器官形态而异，如表2所述。

E 类器官的维持与传代

● 时间 更换培养基10 min；传代1.5 h；3D液滴固化30 min

本流程阐述了将类器官解离成单细胞、重新接种以实现持续培养，以及对扩增后的细胞进行冻存以长期保存的操作方法（图8）。本部分重点在于确保研究人员能够长期维持类器官培养体系，并在后续实验需要时获取细胞。

图8. 类器官传代的实际操作步骤。根据显微镜观察结果选择类器官的传代时间（A）。收获的类器官通过刮取进行物理解离，并在37℃培养箱中进行化学解离（B），逐渐解离为单细胞（C–E）。通过计数细胞数量，确定用于接种以生长下一代类器官的适当数量的BME液滴（F）。

▲关键：关于类器官培养体系的维持，在传至第5、10和20代时，应进行短串联重复序列（STR）分析。该分析用于评估从类器官中提取的DNA的STR图谱是否与从血液或肿瘤组织中提取的基因组DNA（gDNA）的STR图谱相匹配。此过程用于评价培养过程中类器官的遗传一致性，并验证其与原始组织的遗传相似性，可作为遗传指纹。同时，使用支原体PCR检测试剂盒检测支原体污染。

11. 更换类器官生长培养基

a. 每隔3天，从每个孔中吸去现有的培养基，并更换为500 μL新鲜的类器官生长培养基。

▲关键：从孔的角落处轻柔地吸去培养基，以避免吸起BME/类器官液滴。

12. 类器官传代

a. 吸去同一类器官细胞系所有孔中的现有培养基。

b. 向每个基底膜穹顶加入1 mL冷的0.1% BSA-PBS，使用1000 μL移液枪吸头轻柔地上下吹打3-5次，收获类器官。

▲关键：用0.1% BSA-PBS冲洗移液枪吸头有助于防止类器官黏附，并尽量减少样本损失。

c. 重复使用这1 mL溶液，依次处理同一类器官细胞系最多六个孔。

d. 收集完穹顶后，将悬浮液转移至1.7 mL的Eppendorf管中。

▲关键：如果有超过六个孔的样本，将总孔数分成两组，每组使用1 mL溶液进行处理。

e. 使用微量离心机在25°C下以7500×g离心1 min。

▲关键：为确保类器官穿过基底膜层并沉淀到管底，采用高相对离心力（RCF）短时间离心，以尽量减少潜在的细胞损伤。

f. 当溶液分离成三层后，小心吸去上层PBS层，保留1-2 mm厚的中间基底膜层。

▲关键：离心后，由于密度差异，溶液通常会分离成三层：上层为PBS，中间为基底膜，底层为类器官细胞沉淀。

▲关键：如果许多类器官被困在基底膜层中，则多保留一些基底膜层。

g. 向离心管中加入600 μL TrypLE消化液。

h. 将离心管底部轻刮塑料表面（如样品盒隔档）10-15次，帮助松散细胞沉淀（图8B）。

i. 将离心管置于热块中，在37°C下孵育2 min。

j. 在显微镜下检查类器官的解离状态。

k. 重复步骤h-j，直至类器官完全解离为单细胞（最多15 min）（图8C-8E）。

▲关键：虽然可通过移液或轻敲实现物理解离，但我们发现将离心管紧贴塑料表面用力刮擦（例如样品盒隔档）是实现快速解离的最有效方法。该方法能缩短TrypLE暴露时间，并通过更快、更彻底的解离（无论类器官形态如何）减少对类器官的损伤。

l. 将离心管从热块中取出，加入600 μL无血清Advanced DMEM/F12培养基。

m. 在室温（RT）下以360×g离心5 min。

n. 吸弃上清液，注意不要扰动类器官沉淀。

▲关键：为避免吸弃过程中意外丢失类器官沉淀，可在管底保留约100 μL上清液。

o. 加入1 mL 0.1% BSA - PBS溶液，重悬沉淀。

p. 取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合。

q. 将10 μL混合液加载至计数载玻片上，进行细胞计数。

r. 确定接种所需的细胞数量。

▲关键：类器官密度对生长优化至关重要。细胞数量过多会耗尽培养资源，而过少则可能无法提供足够的旁分泌信号以支持正常生长。接种量需根据肿瘤类型和类器官特性调整：生长良好的类器官按每滴3×10⁴个细胞（使用40 μL基底膜）接种；生长较慢的类器官按每滴5×10⁴个细胞接种。

▲关键：若总细胞数超过5×10⁵个，接种4-6滴液滴，并将剩余细胞冷冻保存。

s. 将所需体积的细胞悬液转移至新的1.7 mL Eppendorf管中。

▲关键：根据1 mL悬液中的总细胞数，计算包含所需细胞数量的对应体积。

t. 按照步骤3-e至3-m继续操作（即完成类器官的重新接种与3D液滴固化流程）。

F 类器官冻存与复苏

● 时间 冻存30 min；复苏1 h；类器官培养7天；类器官细胞活性检测1 h

13. 长期冻存类器官

a. 在冻存管上标记类器官名称、传代次数、细胞计数及冻存日期。

b. 将步骤12-s中剩余细胞所在的离心管在25°C下以360×g离心5 min。

c. 吸弃上清液。

d. 向每个储存管（冻存管）中加入300 μL类器官冻存培养基，使用1000 μL移液枪吸头轻柔吹打重悬细胞。

▲关键：每1 mL冻存培养基最多可使用1×10⁷个单细胞。对于第1-4代类器官，每个冻存管约冻存5×10⁵个细胞；对于第5代及以后的类器官，每个冻存管约冻存1×10⁶个细胞。可根据类器官扩增程度调整细胞数量。

e. 将细胞悬液转移至冻存管中，将冻存管放入细胞冻存盒，于-80°C冻存。

f. 次日，将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

14. 类器官复苏

a. 从液氮罐中取出类器官冻存管，将其放入装有液氮的杜瓦瓶中暂存（准备复苏）。

b. 将冻存管置于漂浮管架上，在37°C水浴中解冻1 min，或直至约一半内容物解冻（通常细胞悬液呈半透明状）。

c. 同时，标记一个1.7 mL Eppendorf管，注明复苏的类器官信息（如名称、传代数等），并将其置于试管架上备用。

d. 向冻存管中加入1 mL预温的无血清RPMI 1640培养基（37°C左右）。

e. 使用1000 μL移液枪吸头轻柔吹打约3次，直至细胞完全解冻。

f. 将细胞悬液转移至已准备好的1.7 mL Eppendorf管中。

g. 在室温（RT）下以7500×g离心1 min。

h. 使用1000 μL移液枪吸头吸弃上清液，并用1 mL预温的无血清RPMI 1640培养基重悬细胞。

i. 在室温下以360×g离心5 min。

j. 重复步骤14-h至14-i（即洗涤细胞两次）。

k. 使用1000 μL移液枪吸头吸弃上清液。

l. 将BME分装小份置于冰上备用。

m. 根据冻存时的活细胞数量，用适量BME重悬细胞沉淀（按1×10⁵个细胞/50 μL液滴的密度调整体积）。

▲关键：冻融后为补偿细胞损失，每个穹顶需增加接种细胞量，因此BME体积调整为每滴50 μL（略高于常规用量）。

n. 将细胞-BME悬液逐滴（每滴50 μL）加入24孔板的每个孔中。

o. 将24孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育30 min，使BME固化。

p. 向每个孔中加入500 μL预温的含50 μM Y-27632（ROCK抑制剂）的类器官生长培养基。

q. 将培养板继续置于37°C、5% CO₂培养箱中培养。

r. 3天后，更换为不含Y-27632的常规类器官生长培养基。

15. 冻存类器官的质量控制

▲关键：本步骤与步骤14同步开展。将解冻后的类器官悬液分出一部分接种至96孔板中进行冻存质量评估（QC），其余细胞则接种至24孔板继续培养。

a. 类器官接种至96孔板

i. 按步骤14-a至14-m完成解冻操作。

ii. 使用10 μL移液枪吸头，将2 μL BME-类器官悬液作为三重复（共三孔）接种至96孔板中。

▲关键：剩余细胞悬液按步骤14-n至14-r所述方法继续培养。

iii. 在室温（RT）下孵育2 min后，加入100 μL含50 μM Y-27632（ROCK抑制剂）的预温类器官生长培养基。

iv. 为防止蒸发，在接种孔周围的外围孔中加入200 μL PBS。

v. 将96孔板置于37°C、5%CO₂培养箱中培养。

vi. 3天后，使用200 μL移液枪吸头小心吸弃现有培养基，并更换为不含Y-27632的类器官生长培养基。

b. 类器官活/死染色

i. 准备已接种7天的96孔板（含类器官）。

ii. 根据LIVE/DEAD活力/细胞毒性检测试剂盒说明书，配制染色溶液：向1 mL无血清RPMI培养基中加入0.5 μL 4 mM Calcein AM（钙黄绿素AM）和1 μL 2 mM乙锭同二聚体-1（Ethidium homodimer-1），充分混匀。

iii. 使用200 μL移液枪吸头吸弃96孔板中的培养基。

iv. 向每孔加入100 μL染色溶液。

v. 在室温避光条件下孵育30 min。

vi. 使用Operetta CLS系统采集明场、绿色荧光（活细胞标记）和红色荧光（死细胞标记）图像，并测量荧光强度。

c. 数据分析

i. 按以下公式计算细胞活力：

ii. 细胞活力≥60%的类器官视为合格。

G 384孔板药物响应评估实验的类器官制备

● 时间 接种1.5 h→培养3天→药物处理1 h→继续培养5天→细胞活力检测40 min（图9A）。

图9. 类器官药物检测布局。（A）药物检测的每日时间安排及简要实验细节说明。（B）14种药物的系列稀释板设计以及按浓度进行药物处理的384孔板设计。

▲关键：本方案以单块384孔板检测14种药物的典型设置为例。每种药物设置5个浓度梯度加1个未处理对照（共6个剂量组），每个剂量组设置4个复孔。该设计具有灵活性，可根据实验需求调整药物种类、类器官细胞系数量或孔板布局（图9B）。

16. 准备用于药物反应测定的类器官

a. 重复步骤12-a至12-q，将类器官解离为单细胞并完成细胞计数，用于后续384孔板接种。

b. 计算获得4×10⁵个细胞所需的体积（对应1,000个细胞/孔×400个孔的总需求）。

可选：若需调整实验方案，可通过定义以下变量并计算总细胞数：D = 药物种类数；C = 每种药物的剂量条件数（含对照）；R = 每个剂量组的复孔数；N = 每孔接种细胞数（建议额外增加20%以补偿操作损耗）

总细胞数计算公式：总细胞数 = D × C × R × N

根据图9B的布局示例，按实际实验设计调整上述参数（例如：若检测10种药物，每种药物设4个浓度+1个对照，每浓度3个复孔，每孔1,200个细胞，则总细胞数=10×5×3×1,200=180,000个）。

c. 将计算所得体积的细胞悬液转移至新的1.7 mL Eppendorf管中，用于后续384孔板接种。

17. 类器官接种至384孔板

a. 将800 μL BME加入到7.2 mL预冷的类器官生长培养基中，使BME终浓度为10%。

b. 通过涡旋振荡混匀溶液，随后将混合液置于冰上。

▲关键：为防止BME提前凝固，从混合时刻至接种完成的全程，必须确保BME与类器官生长培养基均保持充分冷却状态并始终置于冰上。

c. 将含有类器官的离心管在360×g下离心5 min。

d. 吸弃上清液。

e. 将7 mL 10% BME溶液转移至无菌试剂储液槽（SPL，货号21102，23050）中。

f. 使用1000 μL移液枪吸头将剩余的1 mL 10% BME溶液与类器官沉淀重悬。

g. 将此重悬液转移至试剂储液槽中。

h. 使用10 mL血清学移液管充分吹打混匀溶液。

i. 使用多通道移液器，将20 μL混合液接种至384孔板除A行和P行外的所有孔中（每孔20 μL）。

▲关键：在384孔板药物实验中，细胞需重悬于含10%BME的类器官生长培养基中。这种低黏度悬液不会形成穹顶结构，可直接通过多通道移液器滴加至孔内完成接种。沿孔壁靠近底部的位置滴加悬液，以避免过早凝胶化。每块孔板接种完成后，轻轻敲击孔板底部（置于台面上）以帮助悬液完全沉降。避免敲击孔板侧壁，以防液滴飞溅。

▲关键：每次吸取悬液前需轻柔晃动储液槽，防止类器官沉淀聚集。

j. 向384孔板的A行和P行每个孔中加入80 μL PBS，用于减少孔内液体蒸发。

k. 接种完成后立即在显微镜下观察孔板，确认类器官悬液分布均匀。

l. 将孔板置于37°C、5%CO₂培养箱中培养3天。

18. 类器官药物处理

a. 药物溶液配制（2×终浓度工作液）

▲关键：由于类器官孔板中的每孔已含有培养基，需将药物预先配制成2×目标终浓度的溶液。当按1:1比例加入孔板时，最终浓度将自动稀释至设定值。一块96孔板的2×药物溶液足够处理两块384孔板的类器官（图9B）。

i. 在无菌试剂储液槽（SPL，货号23050）中配制类器官生长培养基。

ii. 使用多通道移液器，向96孔透明圆底微孔板的A-G行、2-5列及8-11列每孔中加入225 μL类器官生长培养基（共56孔，用于药物梯度稀释）。

iii. 从-80°C冰箱中取出各药物的100×储备液小瓶。

iv. 向96孔板的A-G行、1列和12列每孔中分别加入5 μL 100×药物溶液（共14种不同药物，对应1-12列两端）。

▲关键：若药物最大溶解度低于100×，需调整稀释倍数。

v. 向含有药物的孔中加入245 μL类器官生长培养基（使每孔总体积为250 μL，含100×药物原液）。

vi. 使用多通道移液器进行系列梯度稀释：从1-5列和12-8列依次转移25 μL溶液（相邻列间1:1稀释），不稀释6列和7列。

▲关键：6列和7列可作为未处理对照、溶剂对照或阳性对照。

b. 类器官药物处理操作

i. 在药物处理前一天（第3天），再次检查类器官的形成状态与生长情况。

▲关键：此步骤在初始优化阶段尤为重要，建议同步拍摄图像记录（例如使用Operetta CLS系统）。第3天的图像可作为后续分析的基准，用于评估接种一致性和生长模式。

ii. 使用多通道移液器，从96孔板的每孔中吸取20 μL 2×稀释药物溶液，分别加入384孔板中对应药物的4个复孔中。

▲关键：为多通道移液器的7个通道安装200 μL吸头（实际单次取液量为20 μL/孔）。设置移液器以4倍模式（每通道对应4个孔）分配20 μL/孔，依次从96孔板的最低浓度孔开始，每通道吸取7种不同药物（避免交叉污染）。

iii. 将384孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养5天（药物作用总时长为5天，加上前期培养共8天）。

19. 药物诱导类器官细胞死亡的评估

a. 使用Operetta CLS系统拍摄384孔板中每个孔的类器官形态终点图像，以评估药物诱导的细胞毒性效应。

b. 进行细胞活力检测（CellTiter-Glo 3D法）：

i. 将分装的CellTiter-Glo 3D试剂在4°C下解冻。

ii. 将CellTiter-Glo 3D试剂在22°C-25°C下孵育约30 min，使其平衡至室温（RT）。

iii. 向384孔板中含有类器官的每个孔中加入20 μL CellTiter-Glo 3D试剂。

iv. 用铝箔包裹384孔板，并在室温下继续孵育25 min。

▲关键：孵育过程中需避光，以防止发光信号降解。

v. 使用微孔板振荡器在室温下轻轻振荡孔板5 min，以诱导细胞裂解。

vi. 将384孔板在室温下再孵育25 min。

vii. 使用微孔板读数仪测量发光信号。

20. 药物响应实验的数据分析

a. 将微孔板读数仪获得的原始发光读数导出至电子表格。

b. 评估数据质量与重复性：使用Excel计算阴性对照（未处理孔）和阳性对照（诱导完全细胞死亡的最高药物浓度孔）发光值的Z′因子。

c. 将每个孔的发光值归一化为未处理对照孔的平均值（设定未处理组细胞活力为100%）。

d. 使用GraphPad Prism生成剂量-响应曲线：

i. 在GraphPad Prism中选择New Table & Graph > XY，点击“Enter or import data into a new table”，X轴选择“Numbers”，Y轴选择“Enter replicate values in side-by-side subcolumns”（4个复孔数据并列输入）。

ii. 点击“Create”创建数据表。

iii. 在X列中输入实验使用的药物浓度（建议进行对数转换，如0.1、1、10、100、1000 nM的log₁₀值）。

iv. 在Y列中输入4个复孔对应的细胞活力百分比（%）数据。

v. 输入数据后，点击“Analyze”>“Dose-response–Inhibition”，选择模型“log(inhibitor) vs. response–Variable slope (four parameters)”（四参数对数抑制模型）。

vi. 查看拟合曲线及Prism计算的参数（包括IC₅₀值，即半数抑制浓度）。

▲关键：IC₅₀可用于比较不同药物的细胞毒性效力；但若需比较不同类器官样本的响应模式，分析AUC值更为合适。

vii. 自定义图表以优化可视化效果并导出。

e. 使用GraphPad Prism计算曲线下面积（AUC）：

i. 创建一个参考样本（虚拟组），设定其所有浓度下的细胞活力为100%（作为最大AUC基准）。

ii. 点击顶部Data选项卡中的“Analyze”按钮。

iii. 从分析类型列表中选择“Area under the curve”。

iv. 点击OK获取各样本的AUC值。

v. 将所有AUC值导出至Excel，并按以下公式归一化：

▲关键：归一化后，归一化AUC=1表示无细胞毒性效应（完全存活），归一化AUC=0表示所有浓度下完全丧失活力）。

预期结果

PDO作为精准医学的宝贵模型，能够准确反映患者原始组织的特征。该方案能够从多种样本类型中稳健地建立和扩增类器官，包括手术切除的组织、影像引导的活检（例如EUS-FNB、PLB）以及液体活检（例如腹水和胸腔积液）（图10）。

图10. 按采集方法分类的患者标本图像。

这种广泛的适用性对于无法接受手术的晚期癌症患者尤其有益，因为它可以通过对个体类器官的药物反应评估来促进精准医学。此外，这些方法还可以应用于使用手术标本中获取的邻近正常组织进行类器官生产。

当直接从临床样本中接种时，早期类器官培养通常包含异质性的细胞群体，包括基质细胞、组织碎片、免疫细胞和红细胞（图4）。这些非肿瘤成分会在连续传代过程中逐渐被清除，从而获得纯化的肿瘤类器官（图7）。

经过稳定传代的类器官会呈现出单细胞状态，从这种状态开始，新的类器官会在3天内开始形成，通常直径达到约50微米（图11）。

图11. PDO随时间的序贯生长情况。传代后第1、3、5和7天稳定类器官的生长状态。

在7到10天内，类器官的平均直径达到约150微米。在这个阶段，类器官的形态可以根据癌症类型、诊断或从原始样本保留的基因组特征分为三种类型：囊性、致密型和葡萄状（图12）。大约每两周传代一次，可以在3到4个月内完成多达五次传代。从第三次传代开始，每次传代可以制备一个或多个库存瓶。

图12. 不同癌症类型中PDO的多样形态。来自不同癌症类型的类器官根据其分子特征呈现出多样的形态。

当类器官表现出适当的生长速率，能够进行规律的传代，并且可以可靠地进行库存保存以及肿瘤类器官的充分扩增时，该类器官系被认为已经建立良好且稳定。因此，需要进行质量控制实验以确认它们是否可以解冻并重新生长以用于未来的实验（图13）。这些类器官还可以通过STR分析、苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）染色进行特征鉴定，以评估它们与原始患者来源样本的一致性。

图13. 评估冻融类器官的质量。为评估已建立的类器官系长期冷冻保存及重新培养的可行性，将冷冻的类器官解冻并培养7天。随后对类器官的活性和细胞死亡情况进行评估。

此外，通过细胞活性实验评估类器官对药物的反应性。这使得能够比较不同类器官之间的药物反应，以及单个类器官对多种药物的反应，使用诸如剂量反应曲线得出的曲线下面积（AUC）值和z分数等指标。

这些数据可用于识别药物敏感性、定义治疗窗口，并优先选择进一步临床前验证或个性化治疗策略的候选药物。

总体而言，该协议不仅标准化了类器官的建立和维护，还将下游应用（包括冷冻保存、质量控制和药物筛选）整合到一个统一的流程中。其灵活性和对多种样本类型的适用性增强了实验室之间的可重复性和转化潜力。因此，它为在多样化的研究和临床背景下应用类器官模型奠定了基础，从实时治疗指导到治疗反应的回顾性分析，从而推动了癌症精准医学更具整合性和生物学依据的方法。

材料

生物材料

试剂

试剂配制

参考文献

Kang S, Lee MR, Choi W, Kong SY, Kim YH. Protocol for generation and utilization of patient-derived organoids from multimodal specimen. STAR Protoc. 2025 Sep 19;6(3):104039. doi: 10.1016/j.xpro.2025.104039.

来源：培养盒守护者