比导师讲得还详细的免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

摘要：免疫沉淀技术（Immunoprecipitation, IP）：一种利用特异性抗体结合抗原，并通过沉淀富集的方式从复杂的样本中分离出目标蛋白的方法，可用于检测目标蛋白与其他蛋白或DNA片段之间的交互作用。

免疫沉淀技术（Immunoprecipitation, IP）：一种利用特异性抗体结合抗原，并通过沉淀富集的方式从复杂的样本中分离出目标蛋白的方法，可用于检测目标蛋白与其他蛋白或DNA片段之间的交互作用。

实验原理

将含有目的蛋白的样品溶液与特异性抗体结合，该抗体的Fc片段又能结合到protein A/G上，protein A/G（结合了protein A和protein B的IgG结合结构域，具有与IgG的Fc片段特异性结合的能力，可用于抗体的亲和纯化）通常会固定在琼脂糖凝胶珠或磁珠上，进而吸附目的蛋白，经洗涤去除未结合的杂蛋白，然后煮沸琼脂糖凝胶珠或磁珠使抗体、抗原一起脱落下来，得到的抗体抗原混合物经，Western Blotting 检测，最终依据显影后的胶片上是否有目的大小条带，来判断该抗体是否成功捕获沉淀了目的抗原。

注：在免疫沉淀实验中，Fc片段指的是抗体分子的一部分，它可以与蛋白a或蛋白G偶联的珠子结合。蛋白A和蛋白G是来自某些细菌的蛋白质，它们具有与多种抗体的Fc片段结合的能力，通常被固定在不溶性的载体上。当抗体与目标蛋白结合形成复合物后，蛋白A或蛋白G可以通过其与抗体Fc片段的结合，将整个复合物从溶液中沉淀下来，使得沉淀物易于通过离心等方法收集。

实验应用

①蛋白质相互作用分析：通过使用特定抗体沉淀目标蛋白及其可能的互作蛋白。

②蛋白质复合物的分离：通过IP技术，可以从细胞裂解物中分离出蛋白质复合物，这有助于研究细胞内天然状态下的蛋白质相互作用。

③低丰度蛋白的富集：IP技术可以用于低丰度蛋白的富集和浓缩。

④蛋白质的定性和定量分析：通过IP技术，可以对目标蛋白进行定性和定量分析，例如使用ELISA和Western Blotting等技术。

⑤蛋白质的翻译后修饰研究：IP技术可以用于研究蛋白质的磷酸化、乙酰化等翻译后修饰状态，有助于了解蛋白质的功能和调控机制。

实验步骤

一、制取细胞提取物

①细胞采集：从培养皿中收集细胞，去除原培养基，并用PBS洗一遍。

②裂解细胞：准备冰盒。10cm培养皿加500μL含100×蛋白酶抑制剂(5μL)的弱裂解液，用于裂解细胞膜，释放胞内蛋白。用1mL枪头在培养皿上把细胞刮下来，然后用移液枪把培养皿中的细胞吹打下来并收集到1.5mL Ep管中（10cm培养皿转移两管：实验组＋IgG组），Ep管放冰盒中，此时管口会有很多泡沫，等待其消融。冰上裂解3-4h，隔一段时间把它拿出来颠倒混匀。

注意：使用弱裂解液的目的是保留蛋白质的天然构象。

③离心：13500rpm,15min离心裂解后的细胞，收集上清液（弱裂解产物）至新的Ep管（放冰盒中）。

④抗体结合：弱裂解产物取450μL上清，剩下的50μL作为后期的input对照。加4μL抗体在4℃孵育16h。IgG组也取450μL上清，加入4μL与使用的一抗相同IgG亚类的IgG阴性对照抗体。

注意：

1.IP实验需要设置Input组（阳性对照），IP实验组，IgG组（阴性对照）。

●Input组：总蛋白量的5%-10%

●IP组：1:20-1:100（质量比）

●IgG组：IP抗体的同型对照（阴性对照）

举例：若用200 μg样品进行IP，Input组保留10-20 μg；IP组加入200 μg样品和5 μg IP抗体；IgG组加入200 μg样品和5 μg IgG。

★作为与IP捕获抗实验组相对应的阴性对照组，理论上IgG并不能特异性的与任何蛋白结合，可选用与IP捕获抗体相同物种来源的同型IgG作为阴性对照。

★阴性对照目的：当IgG阴性对照杂出了除轻重链以外的信号时，则说明样本中存在与IgG非特异性结合的蛋白。设置阴性对照可以用于排除样本中非特异性与IgG结合的蛋白，消除样本背景，排除假阳性。

★IgG作为一个独立的对照组（是IP一抗的对照）需要做与实验组完全相同的操作。简单来讲就是把它当作我们的IP捕获抗体去做整个IP实验流程，在后续的WB检测时，其IP产物作为一个独立样本同实验组IP产物一同进行上样检测。

2.抗体选择使用说明书推荐IP应用的抗体。一般IP抗体识别的是蛋白质三级空间结构的位点，而WB抗体只需识别线性结构的位点。当说明书没表明能做IP，优先选能做免疫组化或免疫荧光的抗体。

3.抗体用量根据抗体说明书确定，或根据质量比（1:50-1:200）进行预实验，最适使用量需根据实验摸索。

⑤免疫沉淀：琼脂糖珠（包被了proteinA/G）混匀后吸取40μL到1.5mL Ep管，1500rpm,3min离心，弃上清。加PBS洗一遍（摇晃），1000rpm，离心3min，弃去上清，管子底部的沉淀则是琼脂糖珠。向步骤④中的抗原-抗体复合物加入40μL琼脂糖珠，4℃孵育过夜。

⑥琼脂糖珠清洗：孵育结束后，2000rpm,3min离心，弃去上清，PBS for 5min（洗涤珠子），离心去上清。

注意：

1.琼脂糖珠清洗是为了避免非特异吸附引入过多的杂蛋白。

2.小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A/G 微珠。使用琼脂糖珠时，除去缓冲液可以采用大枪头套小枪头的方法让操作更加精准。

⑦目的蛋白洗脱：加5×loading buffer protein至Ep管中，100℃金属浴15min。

离心后取上清做后续分析。同时取出之前预留的Input，同第⑦步操作。

注意：由于之前加了40μL琼脂糖珠，所以5×loading buffer protein要加8μL。

⑧WB：取部分或全部样品进行WB实验，检测富集蛋白的情况。暂时不用的样品-20℃保存。进行WB时，目的蛋白上样量20μL，Flag上样量3μL，12%-15%的胶都可以。

IP实验结果解读

（1）IP-WB：

Input：指阳性对照，使用预留的细胞裂解液进行WB，以确认目的蛋白的存在，排除假阳性结果的干扰。

IP：指用对应的抗体来富集目的蛋白，例如IP中的a是指用了蛋白a的IP抗体去富集样本中的蛋白a。

WB：用来检测样本中目的蛋白的存在与否，例如WB中的a是指用蛋白a的抗体去检测样本中的蛋白a是否存在。

IgG：IgG是与抗体同种属同亚型的同型对照，用于做IP的阴性对照。它可以确认实验中使用的抗体是否具有特异性，即它们是否只与目标蛋白结合，而不会与其他非目标蛋白发生非特异性结合。如果IgG阴性对照组中没有检测到信号（没有出现条带），这表明抗体是特异性的。

IP-FLAG：说明做免疫沉淀时是用FLAG抗体去拉

根据标注含义分析，结果A和结果B是代表两种不同的结果。这两个结果的Input组都检测到了蛋白a和蛋白b，说明样本中含有这两种蛋白。结果A中，通过蛋白a的抗体进行IP可以靶向蛋白a的同时也沉淀下了蛋白b，表明蛋白a和蛋白b间存在相互作用。反之，结果B的IP样本中没有检测到蛋白b，即说明二者不存在互作。

注意：IP所检测到的相互作用不能反映是直接作用还是间接作用，研究具体作用机制需要进一步分析检测。

【实验结果图解读1】

【实验结果图解读2】

【实验结果图解读3】

（2）IP-MS：

可以进一步定量分析蛋白的丰度和鉴定蛋白间的相互作用。

在定量分析中，关键指标包括Fold Change和Intensity。

Fold Change表示实验组与对照组间蛋白丰度的差异倍数。

Intensity则反映蛋白质的相对丰度。

根据实际情况设定合理的Fold Change阈值和P值，进而评估蛋白表达差异和统计学显著性。

在蛋白互作分析中，重点关注Intensity数值较大且Fold Change较高的蛋白，提示它们可能与目标蛋白有显著的相互作用。同时，需要警惕可能的非特异性结合，特别是当某蛋白的Fold Change和Intensity高于靶蛋白时。

【IP-MS火山图示例】

补充知识：

1、轻重链的产生：

当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候，使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗，会识别捕获抗体变性后的IgG重链和轻链分子，导致出现55kDa重链带，25kDa轻链带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰，影响结果判断。

免疫沉淀复合物主要由三部分组成：Protein A/G，抗体IgG分子，目标蛋白。

在免疫沉淀实验后的WB验证环节中，免疫沉淀复合物SDS-PAGE上样检测后，这些成分都会一起转移到膜上。如图↑

规避轻重链干扰常见的方法：

选择不同种属来源的捕获抗体和检测抗体分别进行IP和WB实验，同时使用与捕获抗体无交叉反应，只针对检测抗体有种属特异性的二抗进行WB实验。

2、做免疫共沉淀时，给目标蛋白带上Flag标签的原因：

①提高检测的特异性：FLAG是一个八肽标签（通常为DYKDDDDK），它能够被特定的抗FLAG抗体识别。使用抗FLAG抗体进行IP实验可以特异性地捕获带有FLAG标签的目标蛋白，减少非特异性结合。

②便于纯化和富集：由于FLAG标签可以被抗FLAG抗体高效识别，这使得带有FLAG标签的蛋白在细胞裂解物中容易被免疫沉淀，从而实现目标蛋白的富集和纯化。

③简化实验操作：如果目标蛋白的内源性抗体不够特异或者难以获得，使用FLAG标签可以简化实验操作，因为抗FLAG抗体是商业上广泛可用的，并且质量可控。

IP常见问题分析：

实验问题1：WB显色结果有大范围的深色背景：

◆可能原因：封闭不充分；一抗的浓度过高或是孵育时间过长；洗膜不充分；抗体特异性不佳；显色时间较长。

★解决方案：孵一抗前可4℃封闭过夜；将一抗稀释至适合的浓度，还可适当缩短抗体孵育时间；抗体孵育后充分洗膜；更换特异性更好的抗体。

实验问题2：免疫沉淀下来的蛋白量较少：

◆可能原因：目的蛋白丰度低；抗体亲和力不足。

★解决方案：若是蛋白本底表达量低，可以考虑将目的基因构建到质粒或病毒载体上进行外源性过表达，若目的蛋白没有合适的抗体，还可以通过融合表达标签蛋白（如3*flag、HA等），借助标签蛋白的抗体进行免疫沉淀；另一方面，可以调整IP的加样顺序，即蛋白丰度低时采用抗原和抗体先结合，再加入磁珠孵育，能更好地富集目的蛋白。抗体方面，需重新更换、测试、评估新抗体的亲和性和特异性。

实验问题3：出现假阳性或假阴性结果：

◆可能原因：抗体与非特异性蛋白交叉反应导致的假阳性；目的蛋白未被沉淀或裂解过程中被降解，导致假阴性。

★解决方案：设置合理的对照。例如对于假阳性，可使用非特异性的IgG抗体作对照；对于假阴性，可充分裂解细胞，操作过程中使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解等。

实验问题4：IP样本洗脱后未检测到目的蛋白：

◆可能原因：洗脱条件不适宜；目的蛋白在该细胞中本底表达量低？

★解决方案：可使用多种洗脱缓冲液进行比较，找到最合适的洗脱条件。一般可分为变性洗脱和非变性洗脱。变性洗脱是用SDS-PAGE上样缓冲液使蛋白变性，可有效解离抗原-抗体的亲和作用，方便后续做WB检测。如果后续需要进行功能性分析，则需要使用非变性的酸性洗脱法（0.1M甘氨酸，pH2.5-3），可解离大多数抗原-抗体互作的同时保留目的蛋白的活性。

实验问题5：Input中无条带但IP中有；或者相反Input中有条带，而IP中没有：

◆可能原因：Input中无条带但IP中有可能是目的蛋白丰度低，WB的一抗不够灵敏，而经IP富集后可检测到；另一种情况则可能是IP所用的抗体是识别蛋白内部的线性表位，而不是构象表位，导致无法捕获目的蛋白。

★解决方案：第一种情况可以选择灵敏度更高的抗体，或通过外源性过表达来提高目的蛋白的丰度；对于第二种情况，在兼顾抗体特异性的同时，选择适用于IP的抗体是关键。

实验问题6：轻重链干扰

轻重链产生的原因：加入的IP抗体和IgG抗体在洗脱时被β巯基乙醇和高温破坏了结构，断裂为组成抗体的轻重链，此时若IP抗体种属与WB抗体种属来源相同，就会被常规Anti-IgG(H+L)（H+L表示使用的免疫原就是抗体轻重链Heavy chain+Light chain）酶标二抗识别，显影时就出现了IP抗体变性后产生的轻重链（轻链25kDa左右，重链55kDa左右），如图1。

★解决办法：

①用不同种属来源的一抗分别进行 IP 和 WB，其缺点是需要买两份一抗，费钱！

②使用特殊的二抗（推荐）

a.专用IP二抗，只与非变性的一抗结合，这类抗体识别空间构象，煮过的抗体失去了空间构象，完美错过；

b.只抗轻链/重链的二抗，若目的蛋白分子量在重链附近，就选择抗轻链的二抗，反之亦然；

③使用共价偶联于beads的抗体进行IP，缺点是基本上只适用标签抗体

④使用直标HRP的一抗作为WB检测抗体，不使用二抗，缺点是使用直标抗体没有信号放大作用，如富集后蛋白丰度不高，信号会比较弱。

实验问题7：Input和IP都有严重杂带

◆问题分析：Input中目的蛋白有条带，但杂带较多，主要问题为抗体特异性差

★解决办法：更换特异性好的抗体，且结果显示该抗体无蛋白富集功能，不适合用于IP实验。此时应暂停IP实验，先测试可以产生Input条带单一，背景干净结果的抗体。

实验问题8：Input条带单一，IP和IgG多条杂带

◆问题分析：Input条带单一，说明样本制备、WB步骤没问题；IP 信号强，蛋白富集效果好，说明IP抗体性能不错，IP和IgG背景都较脏，主要问题在于IP的流程。