表观遗传研究的有力武器——ChIP-seq

摘要：在表观遗传研究中明确蛋白质如何与DNA相互作用对揭示转录调控机制至关重要。染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是破解这一密码的关键钥匙。但单靠ChIP本身还不够，ChIP技术常与二代测序技术(NGS)结合，形成ChIP-Seq技术。今天小源将带大家一起来走进ChI

在表观遗传研究中明确蛋白质如何与DNA相互作用对揭示转录调控机制至关重要。染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是破解这一密码的关键钥匙。但单靠ChIP本身还不够，ChIP技术常与二代测序技术(NGS)结合，形成ChIP-Seq技术。今天小源将带大家一起来走进ChIP-Seq技术。

在介绍ChIP-Seq技术之前，先来了解一下什么ChIP，ChIP是研究植物中蛋白质与DNA相互作用的关键方法，广泛应用于转录因子结合位点分析、组蛋白修饰鉴定及表观遗传调控机制研究。ChIP实现原理是在活细胞状态下通过交联固定蛋白质－DNA复合物，超声破碎为一定长度范围内的染色质小片段，并基于抗原-抗体特异性结合，捕获目标蛋白结合的DNA片段，解交联后，通过对目的片段的纯化与检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP实验流程图

近年来，ChIP‐seq技术已经成为研究的热点之一，ChIP‐seq将二代测序技术与ChIP实验结合，目前广泛应用于分析全基因组范围内DNA结合蛋白位点、组蛋白修饰、核小体定位研究中，在解析基因调控网络、揭示基因组三维结构基础、解读染色质“密码本”方面具有重要意义。

一、ChIP‐seq原理

在完成标准的ChIP实验（交联、裂解、染色质片段化、抗体特异性富集目标蛋白结合的DNA片段）后，将富集到的DNA片段进行高通量测序，最后定位基因组信息，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

二、ChIP-seq实验流程

1.样本固定

首先使用甲醛等交联剂将DNA与其结合的蛋白质固定，形成稳定的化学共价键。这一步骤的目的是保持DNA与蛋白质的相互作用。

2.染色质片段化

接下来，通过超声波或酶解将基因组DNA切割成小片段，通常为200-500 bp。DNA片段大小的均一性非常重要，通常在实验中会对剪切效率进行检测。

3.免疫共沉淀

利用特异性抗体富集与目标蛋白结合的DNA片段。抗体特异性结合目标蛋白，然后通过磁珠或蛋白A/G树脂捕获抗体-蛋白-DNA复合物，并进行洗涤去除非特异性结合。

4.解交联和DNA纯化

通过加热或化学试剂（如蛋白酶K）解除蛋白质和DNA的交联，并提取DNA，得到目标蛋白质结合的纯化DNA片段。

5.文库构建

将提取的DNA片段转化为高通量测序平台可用的测序文库。步骤包括末端修饰、加接头和PCR扩增。

6.高通量测序

使用Illumina平台进行高通量测序，得到目标蛋白结合DNA片段的序列数据。

杨薇, 刘若水.河南科学，2014.

ChIP‐seq实验流程图

三、ChIP‐seq优势及局限性

1.优势：

（1）精准分析：实现在全基因组范围内分析蛋白潜在结合位点，精准测定特定基因或区域的结合情况

（2）高分辨率：结合分辨率可精确到10～30bp

（3）样本量需求小：样本起始DNA量较少，资源有限或稀缺的样本也能获取全基因组范围内特定目的蛋白与DNA互作信息的直观量化数据

（4）多维度数据兼容性：ChIP-seq数据可与RNA-seq、ATAC-seq等数据整合分析

2.局限性：

（1）成本相对较高

（2）数据分析复杂

（3）对于极少数关键位点的绝对定量和快速验证效率不高

（4）抗体高依赖性，ChIP-seq结果很大程度依赖于抗体质量和特异性

四、ChIP‐seq经典应用领域

1.转录因子结合位点研究

ChIP-Seq在该领域的应用最为经典，通过确定特定转录因子在基因组上的精准结合位置（如启动子、增强子、沉默子），揭示其直接调控的靶基因。在Journal of Experimental Botany发表的一篇名为“MYB57 transcriptionally regulates MAPK11 to interact with PAL2;3 and modulate rice allelopathy”研究性论文中，作者利用ChIP-Seq技术筛选出3个受OsMYB57转录调控的基因，并从两个基因（OsMAPK11和OsRTP）中预测到10个OsMYB57在启动子转录调控区的结合位点。

图注：ChIP-Seq预测到的10个OsMYB57结合基序

2.组蛋白修饰图谱绘制

组蛋白修饰图谱绘制是ChIP-Seq极其重要的运用领域，通过使用针对特定组蛋白修饰：H3K4me3（活跃启动子）、H3K27ac（活跃增强子）、H3K4me1（增强子）等的抗体，在全基因组范围内绘制这些修饰的分布图谱，进而研究其与基因表达的关系。在Plant Biotechnology Journal上发表的一篇名为“An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress”的论文中，研究利用ChIP-seq技术对干旱处理下（0 d、3 d、6 d）苹果中6组蛋白修饰（3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）分布区域进行表征，结果表明所有干旱处理下6种组蛋白修饰主要分布在基因转录起始位点（TSS）后2 kb区域中。

图注：基因区域周围6种组蛋白修饰的分布情况

3.核小体定位

核小体定位在基因转录起始阶段、转录延伸阶段、基因表达模式多样化以及可变剪接等过程中发挥着重要的调控作用，因此研究核小体定位具有重要生物学意义。ChIP-seq常用于核小体定位研究中。在 Genome Research 上发表的一篇名为“Determinants of nucleosome positioning and their influence on plant gene expression”的论文中，作者利用ChIP-seq评估核小体占有率与基因表达之间的关系，分析发现与转录丰度较低的基因相比，转录本丰度较高的基因在核小体耗尽区（NDR）和基因区域的核小体占有率往往较低，紧邻TSS下游的核小体定位良好，结果表明核小体占用率与基因表达呈负相关。