摘要：在微生物的世界里，存在着一位古老而致命的“顶级杀手”——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）。它与人类的纠缠已逾数千年，至今仍是全球最主要的传染病死因之一。然而，如果我们打开它的基因组“黑匣子”，却会发现一个令人困惑的
在微生物的世界里，存在着一位古老而致命的“顶级杀手”——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）。它与人类的纠缠已逾数千年，至今仍是全球最主要的传染病死因之一。然而，如果我们打开它的基因组“黑匣子”，却会发现一个令人困惑的现象：与其他许多病原体相比，结核分枝杆菌的基因组异常“保守”和“无聊”。它几乎不进行水平基因转移（horizontal gene transfer），也就是从别的细菌那里“偷”基因来武装自己；它的自发突变率也远低于许多其他病原体。
这样一个在遗传上看似“不思进取”的生物，是如何在人类免疫系统和抗生素药物的双重围剿下，不仅顽强存活，还演化出惊人的多样性，导致不同的临床表型、传播能力和耐药性呢？这个巨大的反差，是微生物学领域一个长期存在的谜题。
9月30日，《Cell》的研究报道“Evolution of Mycobacterium tuberculosis transcription regulation is associated with increased transmission and drug resistance”，为我们揭示了这个“无聊”杀手背后隐藏的、一部精彩纷呈的进化“谍战剧”。研究人员将目光从基因序列本身，转向了基因表达的调控层面，发现结核菌或许并非通过改变武器（基因）本身，而是通过巧妙地调整武器的使用说明书（转录调控），来实现其惊人的适应性。
要解开结核菌适应性之谜，首先需要回答一个问题：不同菌株在面对相同环境时，它们的基因表达模式，也就是内部的“作战计划”，究竟有多大差异？传统的转录组学研究，往往一次只能分析几十个菌株，样本量太少，就像盲人摸象，难以窥见全貌。要真正理解结核菌的演化策略，就需要一个能够同时、高效、低成本地分析成百上千个临床分离株转录组的“超级工具”。
这正是该研究的第一个技术突破。研究人员面临着几大挑战：结核菌生长缓慢，培养周期长；临床菌株的生长速率千差万别，难以标准化；细胞壁厚实，RNA提取困难；更关键的是，细菌的RNA测序（RNA-seq）成本高昂，尤其是去除占绝大多数的核糖体RNA（rRNA）这一步，对于没有poly-A尾的细菌RNA来说尤其麻烦和昂贵。
为此，他们开发了一套巧妙的、名为“池化Taq耗竭RNA测序”（Pooled Taq-depleted RNA-Seq, PTaq RNA-seq）的新技术。这套方法的精髓在于“化繁为简”和“集腋成裘”。
首先，在逆转录环节，他们为每个样本的RNA都加上了独特的分子“条形码”（inline barcodes），这样就可以在早期步骤将多达48个样本的cDNA混合在一起（“池化”），后续所有操作都在一个反应管里完成，极大地简化了流程。其次，他们利用了Taq聚合酶的一种“隐藏技能”，结构特异性核酸内切酶活性。通过设计能与rRNA互补配对并形成特定DNA-RNA杂合结构的“引导”DNA，他们能让Taq酶精准地“剪掉”那些由rRNA逆转录而来的cDNA，从而巧妙地将其从最终的测序文库中“耗竭”掉。这个过程无需复杂的探针捕获或酶消化系统，却能高效去除超过99%的目标序列。
这一系列创新，最终将每个样本的文库制备成本降低到了惊人的约5美元。这把“钥匙”的诞生，意味着大规模、高通量的结核菌转录组学研究从一个遥不可及的梦想变成了现实。手握利器，研究人员得以对来自秘鲁和越南两个临床队列的274株结核菌临床分离株，进行了前所未有的深度转录组分析，开启了一扇观察结核菌演化动态的新窗口。
当274份结核菌的“作战计划”被同时铺开，一幅前所未有的的转录“万花筒”展现在研究人员面前。
分析发现，即使是亲缘关系极近、基因组序列高度相似的菌株，其基因表达谱也可能存在巨大差异。而那些亲缘关系疏远的菌株，虽然整体表达模式仍有一定相关性（最疏远的菌株对之间，其转录组的皮尔逊相关系数均值仍有0.89），但表达差异的广度和深度都更为显著。
为了量化这种关系，研究人员进行了一项精巧的对比。他们构建了两棵“树”：一棵是基于全基因组序列差异的“亲缘关系树”（phylogenetic tree），另一棵是基于151个高表达差异基因表达谱的“表型关系树”（phenotypic tree）。如果基因表达完全由遗传距离决定，那么这两棵树的拓扑结构应该高度一致。
结果发现，在涵盖所有菌株的宏观尺度上，遗传距离与转录表型距离确实高度相关，相关性系数（R²）高达0.89。这说明，大的进化分支（如谱系1、2、4）确实形成了各自独特的转录“底色”，这是长期演化的结果。
然而，当研究人员将视野聚焦于单一谱系内部时，情况发生了戏剧性变化。例如，在谱系2内部，遗传距离对转录表型差异的解释力骤降至17%（R²=0.17）。这意味着，在近代演化中，微小的基因组变异就能引发剧烈的转录“海啸”。一个典型的例子是秘鲁的一个高度传播的进化枝（Peru HT），它在亲缘关系树上只是一个新近分化的小分支，但在转录谱的主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）中，却与它古老的“祖先”菌株形成了泾渭分明的两个集群。
这充分证明，结核菌的转录组并非铁板一块，而是在所有演化时间尺度上，无论是跨越数千年的古老分化，还是近几十年的现代传播，都处在动态变化之中。稳定的基因组背后，正上演着一出波澜壮阔的基因表达调控大戏。
那么，哪些基因是这出大戏的主角呢？研究人员发现，那些表达水平“上蹿下跳”、菌株间差异最大的基因，并非随机分布。它们显著富集在与“宿主-病原体互作”相关的类别中。例如，编码PE/PPE家族蛋白的基因，这是一个在结核菌中迅速扩张、功能神秘但普遍认为与免疫逃逸和营养获取相关的蛋白家族。此外，还有那些对结核菌在宿主体内生存至关重要的基因（in vivoessential genes）和已知的抗原基因。
相反，那些负责核心生命活动（如DNA复制、转录、翻译）的“管家基因”（housekeeping genes），以及在体外培养基中生存所必需的基因，其表达水平在不同菌株间则表现得相当稳定。
这一发现揭示了一个深刻的演化逻辑：结核菌将它有限的“变异资源”精准地投入到了与宿主“斗智斗勇”的最前线。它并没有去轻易改变维持自身生存的基本盘，而是在如何与免疫系统周旋、如何更好地适应宿主体内复杂环境的策略上，不断进行着表达模式的“微调”和“迭代”。这就像一支军队，其后勤补给系统（核心代谢）力求稳定，而前线作战单元（毒力、抗原基因）则必须灵活多变，以应对瞬息万变的战场。
在分析哪些基因的表达变化与特定的基因突变相关联时，研究人员利用全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study, GWAS）锁定了一系列关键的调控关系。其中最引人注目、也最令人费解的发现，与一个名为whiB6的转录调控因子有关。GWAS分析强烈地指出，whiB6基因的多种功能预测性突变，与一个关键毒力操纵子PE35-PPE68-esxBA的表达水平显著下调相关。这个esxBA操纵子编码的，正是大名鼎鼎的ESX-1分泌系统的核心效应蛋白EsxA (也叫ESAT-6) 和EsxB (也叫CFP-10)。ESX-1系统堪称结核菌的“头号凶器”。它像一个分子注射器，能将EsxA/EsxB等毒力蛋白注入宿主细胞质，从而破坏吞噬体的完整性，诱导细胞死亡，并引发强烈的炎症反应。可以说，结核菌的大部分“杀伤力”都源于此。一个最有力的证据是，目前我们广泛使用的卡介苗（BCG vaccine），其之所以减毒，最主要的原因就是在传代过程中丢失了包含ESX-1系统的一段基因组区域（RD1）。
因此，研究人员的发现构成了一个巨大的悖论：为什么一个成功的病原体，会演化出降低其最重要毒力武器表达的突变？这不等于“自废武功”吗？
为了验证这一关联的真实性，研究人员进行了严谨的实验。他们从临床菌株中挑选出三对亲缘关系极近、但在whiB6基因上恰好一株为野生型、一株为突变型的“姐妹菌”。通过蛋白质印迹（Western blot）技术，他们直接检测了这些菌株分泌EsxB蛋白的水平。结果显示，无论是细胞内的蛋白积累量，还是分泌到培养基中的蛋白量，所有三株携带whiB6突变的菌株，其EsxB蛋白水平均显著低于它们对应的野生型“姐妹菌”。这为whiB6突变导致ESX-1毒力系统表达下调提供了坚实的证据。为了探究这种“自废武功”的现象是否只是个别菌株的“怪癖”，研究人员利用一个包含了全球超过55,000株结核菌基因组的庞大数据库，追溯whiB6突变的演化历史。结果再次令人震惊。whiB6的功能丧失性突变并非罕见事件，而是在全球不同结核菌谱系中反复、独立地出现。在谱系2和谱系4中，研究人员观察到超过600次独立的whiB6突变事件，分别影响了7.0%和2.5%的菌株。更夸张的是在谱系1中，高达67.1%的菌株都携带whiB6的突变，这些突变主要由4个古老的、并成功扩散开来的等位基因所驱动。如此高频率的反复出现和广泛传播，强烈暗示着这些降低毒力的whiB6突变，非但不是有害的，反而在自然选择中具有某种强大的优势。顶级杀手“自废武功”的背后，必然隐藏着一笔更为划算的进化“交易”。这笔交易是什么？研究人员提出了一个经典的“毒力-传播权衡”（virulence-transmission trade-off）假说来解释这个悖论。
这个假说的核心思想是，病原体的终极“目标”不是杀死宿主，而是最大化自身的传播和繁衍。过高的毒力虽然能让病原体在单个宿主体内快速增殖，但也可能导致宿主过早死亡，或者因为症状严重而被迅速隔离和治疗，从而切断了传播链。相反，适度降低毒力，维持一种更“温和”或甚至是无症状的感染状态，可能会延长感染期，让宿主作为一个“移动的传染源”在人群中活动更长时间，从而在总体上实现更高的传播效率。
这就像一场投资，一种策略是“短线爆炒”，风险高、收益快；另一种是“长线持有”，收益平稳但持久。结核菌似乎在某些情况下，选择了后者。
研究人员接着从庞大的基因组数据中寻找支持这一假说的证据。他们将目光投向了另一个巨大的选择压力——抗生素。自20世纪中期以来，抗生素的广泛使用，对结核菌的生存构成了前所未有的挑战。
分析发现，在演化上更为“现代”（即更晚近出现）的whiB6突变，尤其是在谱系2和谱系4中，与耐药基因的出现存在着强烈的关联。这暗示whiB6突变可能与耐药性的获得或耐药菌株的传播有关。为了直接衡量传播效率，研究人员使用了一个巧妙的群体遗传学指标，“末端分支长度”（terminal branch length）。在进化树中，一个菌株的末端分支长度，可以近似地反映其从最后一次成功传播到被采样的时间间隔。较短的末端分支，通常意味着该菌株谱系正处于快速扩张和传播的阶段。
当他们比较携带whiB6突变的进化枝和随机选取的进化枝时，一个清晰的模式浮现了：在谱系2和谱系4中，携带whiB6突变的菌株谱系，其平均末端分支长度显著更短。这意味着，它们的传播速度更快。更有趣的是，当研究人员将菌株分为耐药和敏感两组后，发现这种“传播优势”在耐药菌株中尤为显著。在耐药的谱系2菌株中，whiB6突变与传播加速的关联性达到了极高的统计学显著性（经验p值 。
所有这些证据链条拼接在一起，描绘出了一幅惊人的演化图景：在抗生素时代，某些结核菌通过whiB6突变，主动调低了其核心毒力系统ESX-1的表达。这种“低毒力”表型，可能帮助它们更好地在宿主体内潜伏，逃避免疫系统的猛烈攻击，也可能降低了被临床诊断和治疗的概率。这种策略在耐药菌株中似乎尤其有利，使它们能够以一种更“隐蔽”的方式在人群中高效传播。这是一种典型的、为了长期生存和广泛传播而牺牲短期“杀伤力”的演化权衡。
whiB6-ESX-1的故事固然精彩，但结核菌的“监管艺术”远不止于此。这项研究还揭示了其他同样有趣的调控演化案例，证明这是一种普遍的适应策略。另一个主角是名为slfR（Rv0042c）的基因。GWAS分析发现，slfR基因的突变与另一个操纵子pks2-papA1-mmpL8的表达上调有关。这个操纵子负责合成一种名为“硫脂-1”（Sulfolipid-1, SL-1）的细胞壁脂质。最近的研究表明，SL-1是一种强效的“咳嗽诱导剂”，它能直接激活宿主的伤害性感受神经元，引发咳嗽反射，从而促进细菌的呼吸道传播。研究人员通过体外实验证实，slfR编码的是一个转录抑制因子，它能直接结合到pks2操纵子的启动子区域，抑制其转录。当slfR发生功能丧失性突变时，这种抑制被解除，导致SL-1的合成和运输被“激活”。这又是一个通过调控因子突变来精细调节与宿主互作（这里是诱导咳嗽）的鲜活例子。更有意思的是，演化策略还表现出明显的“谱系特异性”。whiB6介导的ESX-1下调，主要发生在谱系2和谱系4。而在古老的谱系1中，虽然也存在广泛的whiB6突变，但它们似乎还采用了另一种截然不同的策略来“改造”ESX-1系统。谱系1菌株中广泛存在着espACD操纵子启动子区域的变异，主要是两个大片段的独立缺失。这个操纵子编码的蛋白也是ESX-1系统正常运作所必需的。与whiB6突变导致表达下调相反，谱系1中的这些启动子变异，反而导致了espACD这呈现出一幅更为复杂和微妙的图景：在不同的进化背景下，结核菌似乎在对ESX-1这个核心毒力系统进行着不同方向的“定制化改造”。谱系2和谱系4倾向于“做减法”，整体性地降低ESX-1的活性；而谱系1则可能在下调esxBA的同时，通过“做加法”来上调espACD，或许是为了补偿某些特定功能的丧失，或者是在演化压力下寻求一种新的功能平衡。这些发现共同指向一个核心结论：转录调控的演化，是结核分枝杆菌适应性演化的一个核心驱动力。它就像一个经验丰富的音响师，不是去更换乐器（改变基因），而是通过精细地调节调音台上的成百上千个推子（调控因子），来为不同的“演出场地”（不同的宿主、有无药物压力）谱写出最合适的“交响乐”。
这项研究不仅仅是一次对结核菌演化机制的深入探索，其发现对我们未来的结核病防控策略也提出了深刻的警示和启示。
首先，它挑战了我们对疫苗设计的传统思路。许多在研的新一代结核病疫苗，都将ESX-1系统的核心效应蛋白EsxA/EsxB作为关键的抗原靶点，希望通过它们来激发强大的保护性免疫。然而，这项研究揭示，全球大量的临床菌株，尤其是那些传播能力更强、更易耐药的菌株，正在自然演化中主动下调这些蛋白的表达。这意味着，依赖这些抗原的疫苗，其有效性可能会因为菌株的表达变异而大打折扣，甚至完全失效。病原体已经“预判”了我们的策略，并提前演化出了规避方案。
其次，这也对现有的结核病诊断技术构成了潜在威胁。目前广泛使用的γ-干扰素释放试验（Interferon-Gamma Release Assays, IGRAs），其诊断原理就是检测人体T细胞在接触到EsxA/EsxB等特异性抗原后产生γ-干扰素的水平。如果感染人体的结核菌株恰好是whiB6突变株，其EsxA/EsxB的表达量本身就很低，这是否会导致假阴性结果的出现，从而造成漏诊？虽然这还需要进一步的临床数据验证，但无疑为我们敲响了警钟。最后，这项研究揭示的“毒力-传播权衡”策略，尤其是与耐药性相伴的“隐蔽传播”模式，为公共卫生干预提出了新的难题。我们可能需要重新思考，仅仅关注和治疗那些表现出典型症状的重症患者是否足够。那些携带“低毒力”突变、可能长期处于无症状或轻症状态的感染者，或许才是耐药结核菌在社区中“潜行”和扩散的巨大“冰山”。如何有效地发现和管理这部分“沉默的传染源”，将是未来结核病控制工作面临的重大挑战。
总而言之，该研究通过技术创新和大规模数据分析，为我们描绘了一幅前所未见的结核菌演化全景图。它告诉我们，面对这个古老而狡猾的对手，我们不能再仅仅满足于研究它“是什么”（基因组序列），而必须更深入地理解它“做什么”以及“如何做”（转录调控和表型可塑性）。这位看似“无聊”的杀手，其真正的可怕之处，或许正是在于它那深不可测的、于无声处听惊雷的监管艺术和演化智慧。未来的战场，将是围绕着理解和干预这种动态适应性的认知之战。
参考文献
Culviner PH, Frey AM, Liu Q, Ha DTM, Thai PVK, Thu DDA, Quang NL, Calderon R, Lecca L, Caws M, Dunstan SJ, Murray MB, Thuong NTT, Fortune SM. Evolution of Mycobacterium tuberculosis transcription regulation is associated with increased transmission and drug resistance. Cell. 2025 Sep 30:S0092-8674(25)01036-0. doi: 10.1016/j.cell.2025.09.005. Epub ahead of print. PMID: 41033311.
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来源：生物探索一点号1