摘要：在生命科学的宏伟画卷中，总有一些领域，我们自以为洞若观火，却始终无法触及其最核心的奥秘。鸟类，尤其是我们餐桌上最熟悉的鸡，就是这样一个例子。长久以来，鸡不仅是全球数十亿人的蛋白质来源，更是发育生物学、病毒学和免疫学研究中不可或缺的模型生物。我们借助鸡胚这扇“透
在生命科学的宏伟画卷中，总有一些领域，我们自以为洞若观火，却始终无法触及其最核心的奥秘。鸟类，尤其是我们餐桌上最熟悉的鸡，就是这样一个例子。长久以来，鸡不仅是全球数十亿人的蛋白质来源，更是发育生物学、病毒学和免疫学研究中不可或缺的模型生物。我们借助鸡胚这扇“透明的窗户”，窥见了生命从单细胞走向复杂个体的壮丽过程。
然而，在这扇窗户背后，一直存在一个令人尴尬的“盲区”。与哺乳动物（尤其是小鼠）的研究相比，我们对鸟类的基因操作能力显得捉襟见肘。研究人员可以随心所欲地“敲除”或“敲入”小鼠的任意基因，创造出各种疾病模型，从而深刻地改变了我们对生命和疾病的理解。但在鸟类身上，实现这样精准的基因编辑，长期以来都是一个遥不可及的梦。这背后的根本瓶颈，在于一种关键的生物学工具的缺失——稳定、且具备生殖系传递能力的胚胎干细胞 (germline-competent embryonic stem cells, ES cells)。
现在，这个困扰了学界数十年的难题，终于迎来了历史性的突破。9月30日，《Nature Biotechnology》的研究报道“Derivation of embryonic stem cells across avian species”，系统性地解决了鸟类胚胎干细胞的体外培养难题。这不仅仅是一项技术的革新，它更像一把钥匙，即将开启一扇尘封已久的大门，通向鸟类基因工程、物种保护乃至生物医药的全新疆域。
要理解这项突破的意义，我们首先需要明白，为何之前的路总是走不通。
胚胎干细胞，被誉为生命科学领域的“万能种子”。它们源自早期胚胎，拥有两大“神力”：其一是多能性 (pluripotency)，即在理论上可以分化成构成身体的所有类型的细胞，从跳动的心肌细胞到传递信息的神经元；其二是生殖系传递能力 (germline competence)，当这些细胞被重新注入一个早期胚胎并发育成嵌合体动物后，它们能够进入生殖腺，最终形成精子或卵子，从而将自身的遗传信息传递给下一代。
正是这第二种能力，让小鼠胚胎干细胞成为了基因编辑的“黄金载体”。研究人员可以在体外对小鼠ES细胞进行精准的基因改造，然后筛选出成功编辑的细胞，将其注入囊胚，就能获得携带特定基因修饰的后代。这一流程化的技术，催生了数以万计的基因敲除小鼠模型，彻底改变了现代生物医学研究的范式。
然而，这套在小鼠身上玩得炉火纯青的技术，在鸟类身上却屡屡碰壁。过去几十年来，全球各地的实验室都曾尝试建立鸟类的ES细胞系。虽然也分离出了一些“貌似”干细胞的细胞系，但它们都有一个致命的缺陷：在体外培养传代数次后，就会迅速失去那宝贵的“神力”，特别是形成嵌合体和进入生殖系的能力会急剧下降甚至完全丧失。这些细胞就像失去了魔力的灰姑娘，一旦过了某个“时间点”，就变回了普通的模样。
这种持续的失败，甚至让学界产生了一种主流假说：鸟类的生殖细胞起源模式可能与哺乳动物根本不同。在小鼠中，生殖细胞是由外胚层细胞 (epiblast cells) 在特定信号“诱导”下形成的；而在鸟类中，它们可能是在卵子形成过程中，由母源物质“预先决定”的。如果真是这样，那么从外胚层细胞建立的ES细胞，或许从一开始就“命中注定”无法转化为生殖细胞。这无疑为鸟类ES细胞的研究蒙上了一层厚厚的阴影，仿佛一条无法逾越的鸿沟。
这项研究的突破，始于一个非常巧妙的观察。
研究人员的起点，是刚刚产下的鸡蛋中的早期胚胎——处于EGK.X分期的鸡胚盘 (blastoderm)。他们首先尝试了哺乳动物干细胞培养中常用的“鸡尾酒配方”，筛选了一系列小分子抑制剂。很快，他们发现，当同时抑制Wnt信号通路（使用抑制剂IWR-1）和PKC信号通路（使用抑制剂Gö6983）时，培养皿中出现了形态良好的未分化细胞集落。这似乎是一个不错的开端。
然而，老问题再次出现。这些细胞虽然在初期看起来很“干”，但在传代一到两次后，便开始不可避免地走向分化，无法长期维持。正当研究陷入僵局时，一个细节引起了他们的注意：在分离胚胎盘的操作中，如果“不小心”带入了更多的残留蛋黄，这些细胞的生长状态似乎会更好。
这个偶然的发现，如同黑暗中的一道闪电，照亮了前行的方向。研究人员大胆假设：或许，蛋黄中含有某种神秘的、对维持鸡ES细胞多能性至关重要的活性成分！
为了验证这个猜想，他们设计了一个直接的实验：在之前发现的“双抑制剂”(2i) 培养基中，直接添加了3%的蛋黄。结果令人振奋！原本只能维持几天的ES细胞，在添加了蛋黄后，奇迹般地实现了稳定增殖，可以连续不断地传代培养，并且始终保持着典型的未分化形态。无论是来自受精蛋还是未受精蛋的蛋黄，都同样有效。这意味着，他们终于找到了那把失落已久的钥匙，成功打开了长期维持鸟类ES细胞的大门。这个全新的培养体系，他们称之为“Yolk/2i”。
找到了“藏宝图”（蛋黄），下一步就是找出宝藏本身。蛋黄是一个成分极其复杂的混合物，里面有成百上千种蛋白质、脂质和各类分子。究竟是哪一个或哪几个分子在发挥关键作用？接下来，研究人员上演了一场精彩的“分子侦探”大戏。
他们的策略是生物化学分离纯化 (biochemical fractionation)，就像用不同规格的筛子，从一堆沙石中逐步筛选出金子一样。
第一步：粗筛——血浆与颗粒。他们通过高速离心，将蛋黄分成了上清液（血浆，plasma）和沉淀物（颗粒，granules）。分别测试后发现，促进细胞自我更新的活性，全部存在于血浆部分。目标范围缩小了。
第二步：中筛——按分子量大小。他们利用不同孔径的分子量截留膜 (molecular-weight cutoff membrane)，将蛋黄血浆进一步分成了三组：>100 kDa、50-100 kDa和只有50-100 kDa这个区间的组分，能够有效地维持ES细胞的未分化状态。侦探的目光，已经锁定在了一个更精确的范围内。
第三步：精筛——蛋白沉淀。针对50-100 kDa的活性组分，他们使用了经典的硫酸铵沉淀法 (ammonium sulfate precipitation)。通过逐步提高硫酸铵的浓度，可以让不同的蛋白质先后从溶液中沉淀出来。他们发现，当硫酸铵饱和度达到80%时沉淀下来的那部分蛋白（简称80p），展现出了最强的促进ES细胞自我更新的活性。
最后一步：验明正身——质谱分析。研究人员将这个“80p”组分通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，发现在大约75 kDa的位置有一条非常明显的蛋白条带。他们切下这条带，送去做质谱分析 (mass-spectrometry analysis)。最终的鉴定结果水落石出——这个神秘的功臣，就是鸡卵中的一种主要蛋白质：卵转铁蛋白 (ovotransferrin)。
为了最终确认，他们直接用市售的纯化卵转铁蛋白，代替了整个蛋黄组分。结果完美复现！卵转铁蛋白与两种抑制剂（IWR-1和Gö6983）的组合，就足以在体外长期稳定地培养鸡ES细胞。有趣的是，他们还测试了卵转铁蛋白在哺乳动物中的“亲戚”——血清转铁蛋白 (serum transferrin)，却发现它完全没有效果。这有力地证明了卵转铁蛋白在维持鸟类多能性方面，扮演着一个物种特异性的、不可替代的角色。
既然已经破译了鸡ES细胞的“培养密码”，一个更宏大的问题摆在了面前：这套配方，能否通用地应用于其他鸟类？毕竟，鸟类世界的多样性远不止于鸡。
研究人员立刻将他们的新配方“OT/2i”（卵转铁蛋白+双抑制剂）应用到了其他几种重要的鸟类身上，包括雉（pheasant）、鸭（duck）和火鸡（turkey）。很快，新的挑战出现了。虽然这些物种的胚胎细胞在OT/2i培养基中也能形成ES细胞样的集落，但它们会迅速地、自发地分化成跳动的心肌细胞 (cardiomyocytes)。培养皿中出现成片搏动的细胞，这虽然景象壮观，但对于维持干细胞而言却是一个坏消息。
这意味着，不同鸟类对信号通路的精细调控存在差异。通过进一步的筛选，研究人员发现，在OT/2i的基础上，再添加一种名为SB431542的抑制剂，可以有效地阻断这种心肌细胞分化。SB431542能够抑制Activin/Nodal信号通路，该通路在心脏发育中起着关键作用。这个升级版的“三抑制剂”配方——“OT/3i”，成功地让雉、鸭和火鸡的ES细胞也稳定了下来。
然而，当他们转向鹌鹑 (quail) 时，OT/3i配方又不够用了。鹌鹑ES细胞仍然无法长期维持。通过不懈的尝试，他们发现，必须额外添加一种细胞因子——鸡白血病抑制因子 (chicken leukemia inhibitory factor, chLIF)，才能最终“驯服”鹌鹑ES细胞。
至此，一个更加强大和通用的鸟类ES细胞培养“鸡尾酒”配方，“OT/3i/chLIF”，正式诞生。利用这个终极配方，研究人员势如破竹，成功地从鸡、鹌鹑、鹅、鸭、火鸡、雉乃至美丽的孔雀 (peafowl)等七种不同的鸟类中，建立了稳定的ES细胞系。
更有趣的是，这套配方也揭示了物种间的微妙差异。例如，在鸵鸟 (ostrich) 身上，OT/3i配方是有效的，但一旦加入chLIF，反而会诱导细胞分化。深入的转录组分析揭示了原因：鸵鸟ES细胞中LIF受体的表达水平远高于其他鸟类，导致它们对LIF信号“过度敏感”。这说明，即使是保守的信号通路，在不同物种中也可能存在一个最佳的“活性窗口”，过犹不及。
建立了细胞系只是第一步，更关键的问题是：这些在培养皿中生长了数十代的细胞，是否还保持着ES细胞真正的“灵魂”——多能性和生殖系能力？研究人员动用了一系列“火眼金睛”般的现代生物学技术，对它们进行了全方位的严格“体检”。
身份鉴定：它们在发育时钟上处于什么位置？
通过RNA测序 (RNA-sequencing)，研究人员读取了这些细胞中所有活跃的基因信息，绘制出它们的“分子身份证”。主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA)的结果显示，这些体外培养的鸡ES细胞，在基因表达谱上与它们最初的来源，EGK.X期的胚胎盘细胞，高度相似，而与更早或更晚发育阶段的胚胎细胞则明显不同。这证明，他们的培养体系成功地“定格”住了胚胎发育中那个特定的、充满潜能的瞬间。
更有深度的是，他们将鸡ES细胞的基因表达谱与小鼠不同多能性状态的干细胞（包括原始态naive、形成态formative和始发态primed）进行了跨物种比较。结果发现，鸡ES细胞与小鼠的形成态多能性干细胞 (formative pluripotent stem cells)最为相似。这是一个非常重要的结论。形成态被认为是介于“一切皆有可能”的原始态和“蓄势待发”的始发态之间的一个关键过渡阶段，这个阶段的细胞已经为响应分化信号做好了准备。这与鸡胚在产蛋时的发育状态（已经历了部分早期分化）高度吻合，也解释了为何这些细胞在体外能迅速分化。
能力测试之一：嵌合实验见真章
证明多能性的黄金标准，是看它们能否在真实胚胎中“大显身手”。研究人员将这些ES细胞用绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein, GFP)标记上，然后将它们小心地注射回一个正常的、未标记的早期鸡胚中。这个过程就像是给一支军队派去了“特种兵”，看它们能否融入并参与作战。
结果令人惊叹。在体外（ex ovo，一种模拟孵化的培养系统）和体内（in ovo，在蛋壳内）的嵌合实验中，这些发出绿色荧光的ES细胞，都完美地整合进了宿主胚胎中，并随着胚胎的发育而增殖、分化。在发育的胚胎中，可以看到闪亮的绿色细胞广泛地分布在各个组织和器官中，包括正在形成的神经管（未来大脑和脊髓的雏形）、体节（未来肌肉和骨骼的来源）等等。
他们还发现，提高嵌合效率有一个诀窍：在注射ES细胞之前，用适度的亚致死剂量辐射 (sublethal irradiation)（500-550 cGy）处理宿主胚胎。这种辐射可以清除一部分宿主自身的细胞，为外来的ES细胞“腾出”更多的生态位，从而使得嵌-合-体中供体细胞的比例大大提高，形成了高等级嵌合体 (high-grade chimeras)。
能力测试之二：羽毛作证的功能性整合
为了提供更直观、更具功能性的证据，研究人员进行了一项极为巧妙的实验。他们从一种羽毛呈棕色的鸡品种，罗德岛红鸡 (Rhode Island Red)，建立了ES细胞系，然后将其注入到一种羽毛纯白的鸡品种，白来航鸡 (White Leghorn)，的胚胎中。
几个月后，奇迹发生了。从这些嵌合胚胎中孵化出的雏鸡，长大后身上出现了非常明显的“混色羽毛”——在原本纯白的羽毛中，点缀着一块块棕黑色的区域。这生动地证明了，来自罗德岛红鸡的ES细胞，在白来航鸡的身体里成功分化成了功能性的黑素细胞 (melanocytes)，并产生了色素。通过显微镜观察和分子标记染色（MITF染色），他们进一步确认，这些有颜色的羽毛区域，确实充满了来自供体鸡的、表达GFP的细胞。
能力测试之三：触及圣杯，它们能成为生殖细胞吗？
这是所有测试中最核心、也最令人期待的一项。这些ES细胞是否具备生殖系能力？
研究人员细致地观察了嵌合体胚胎的生殖腺 (gonads)发育过程。在发育到第9天的雄性嵌合胚胎的睾丸中，他们发现了成簇的、同时表达GFP（供体细胞标记）和DAZL（一种关键的生殖细胞标记蛋白）的细胞。在发育到第15天甚至更晚的胚胎中，这些源自ES细胞的生殖细胞簇变得更大，并且开始表达另一种生殖细胞表面抗原SSEA-1。在即将孵化的E21胚胎中，他们甚至观察到，这些GFP阳性的生殖细胞，已经成功地迁移并定居在了生精小管 (seminiferous tubules)内部——这正是未来产生精子的地方。
这些层层递进的证据，有力地证明了，他们建立的鸟类ES细胞，确实拥有分化成原始生殖细胞 (Primordial Germ Cells, PGCs)的能力。它们不仅是“万能”的，更是“可传承”的。
证明了这些细胞的真实身份后，研究人员立即展示了它们作为基因工程平台的巨大潜力。他们使用强大的CRISPR-Cas9基因编辑技术，对携带GFP基因的鸡ES细胞进行了一次“外科手术”，成功地将GFP基因的原序列修改，使其转而表达蓝色荧光蛋白 (Blue Fluorescent Protein, BFP)。流式细胞术分析显示，基因编辑的效率非常可观，有9.3%的细胞实现了完全的GFP到BFP的转换。这清楚地表明，这些细胞是理想的基因编辑“操作台”。
这项研究的成功，意味着鸟类生物学研究的工具箱，终于被补上了最关键的一块拼图。它所带来的变革将是深远而广泛的：
基础研究的“加速器”：研究人员终于可以像在小鼠中那样，系统性地制造基因敲除鸡，来研究特定基因在鸟类独特的胚胎发育、免疫系统、行为模式以及对禽流感等病毒的反应中的功能。无数悬而未决的科学问题，如今都有了被解答的可能。
现代农业的“新引擎”：在家禽育种领域，传统方法耗时漫长且效率有限。利用这项技术，未来可以对鸡、鸭、鹅等家禽进行精准的基因改良，培育出抗病能力更强（例如抵抗禽流感）、生长速度更快、产蛋品质更优或饲料转化效率更高的新品种，为保障全球粮食安全提供强大的技术支持。
生物医药的“新工厂”：鸟类的蛋，特别是鸡蛋，是一个天然的、高效的“生物反应器”。通过对鸡ES细胞进行基因编辑，未来可以培育出能在蛋清中大量生产高附加值药用蛋白（如抗体、疫苗、酶等）的“工程鸡”，从而大幅降低某些昂贵药物的生产成本。
濒危物种的“诺亚方舟”：许多鸟类正濒临灭绝，保护其遗传多样性迫在眉睫。这项技术可以被用来建立濒危鸟类的ES细胞库，相当于为其物种基因组建立了一份“活的备份”。在未来，这些细胞或许可以通过跨物种嵌合等技术，帮助恢复濒危物种的数量，甚至为复活渡渡鸟等已灭绝鸟类的宏伟设想，提供了一丝理论上的可能。
当然，任何一项开创性的研究，在迈出决定性的一大步后，总会留下一些等待完善的细节。该研究中，研究人员也坦诚地指出，尽管他们已经充分证明了ES细胞能够形成生殖细胞并定居于生殖腺，但他们尚未完成最终的“临门一脚”，即通过这些嵌合体鸡，成功获得由ES细胞产生的后代（即生殖系传递）。他们分析，这很可能是由于实验中所使用的不同鸡品种之间存在品系不相容性 (strain incompatibility)，导致高等级的嵌合体胚胎在孵化后期死亡率较高。
然而，这更像是一个技术层面的工程挑战，而非原理上的根本障碍。通过使用遗传背景更匹配的供体和受体品系，这个问题在未来的研究中很有可能被解决。
毫无疑问，这项研究的核心成就，建立稳定、可传代、可编辑且具备生殖系能力的鸟类胚胎干细胞，已经为整个领域奠定了一块坚实无比的基石。它不仅填补了长达数十年的技术空白，更重要的是，它彻底改变了游戏规则。
我们可以预见，在不远的未来，第一只由基因编辑ES细胞产生的“设计鸟”，将破壳而出。到那时，我们将不仅能更深刻地理解这些翱翔于天际的美丽生灵，更将拥有一种前所未有的强大力量，去守护它们、改良它们、并借助它们来改善我们人类自身的生活。这扇刚刚被开启的大门背后，是一个充满无限可能的崭新世界。
参考文献
Chen X, Guo Z, Tong X, Wang X, Liu X, Nagai H, Wu P, Lu J, Huss D, Tran M, Readhead C, Wu C, Cao L, Huang Y, Zeng Z, Feng F, Adhami N, Mor S, Lansford R, Chuong CM, Sheng G, Lois C, Ying QL. Derivation of embryonic stem cells across avian species. Nat Biotechnol. 2025 Sep 30. doi: 10.1038/s41587-025-02833-3. Epub ahead of print. PMID: 41028831.
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来源：生物探索一点号1
