国产顶刊发文！北京协和医院团队发现SLE肺高压关键基因TRAF5

摘要：系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的多器官自身免疫性疾病，肺动脉高压（PAH）是其最严重的并发症之一，常引发右心衰竭且死亡率高。尽管近年来对SLE的病理机制已有较为深入的研究，然而SLE与PAH共有的遗传易感基因、分子病理及共同治病通路仍尚未明晰。且因样本量有

系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的多器官自身免疫性疾病，肺动脉高压（PAH）是其最严重的并发症之一，常引发右心衰竭且死亡率高。尽管近年来对SLE的病理机制已有较为深入的研究，然而SLE与PAH共有的遗传易感基因、分子病理及共同治病通路仍尚未明晰。且因样本量有限、疾病异质性等问题，SLE-PAH的研究较为薄弱，缺乏有效的诊断标志物与治疗靶点。

近日，北京协和医院风湿免疫科赵久良、曾小峰团队与中国医学科学院北京协和医学院药物研究所方莲花团队合作，在The Innovation发表了题为“Rare TRAF5 coding variants in systemic lupus erythematosus patients aggravate pulmonary hypertension via endothelial dysfunction”的研究论文。研究发现SLE-PAH患者中存在罕见的TRAF5编码区变异，这些变异通过导致内皮细胞功能障碍加重PAH。进一步研究表明，内皮特异性TRAF5过表达可缓解小鼠模型中的肺血管重塑，表明TRAF5可能成为SLE-PAH新的早期诊断及治疗靶点。

研究人员在238例SLE-PAH患者中鉴定出10670个基因的23034个罕见有害变异，虽在5%假发现率（FDR）阈值下无显著基因，但26个基因（每个基因至少5个罕见变异）在SLE-PAH组、SLE-nonPAH组及健康对照组间存在明显差异。

Sanger测序验证显示，TRAF5是其中最具代表性的基因之一。在293T细胞中过表达两种TRAF5变异体，蛋白表达均明显低于野生型；AlphaFold和PYMOL预测显示TRAF5的N端RING结构域（泛素化功能）和C端MATH结构域（受体结合功能）的变异会影响蛋白稳定性。

Western blot结果证实P503R错义突变质粒转染后TRAF5蛋白水平降低，且野生型TRAF5过表达可挽救TRAF5敲低肺动脉内皮细胞（PAECs）的凋亡，而变异型无法挽救；RNA测序显示携带TRAF5变异的SLE-PAH患者外周血TRAF5mRNA表达显著低于无变异的SLE-PAH患者和SLE-nonPAH患者。

图1 与系统性红斑狼疮合并肺动脉高压（SLE-PAH）相关的TRAF5功能缺失型变异的发现

研究团队构建了TRAF5敲除（TRAF5-/-）小鼠，这些小鼠无发育异常，但肺组织TRAF5mRNA和蛋白表达降低。pristane注射后1个月内，TRAF5-/-小鼠存活率低于野生型小鼠，且死亡的TRAF5-/-小鼠出现右心室肥厚。

pristane注射组小鼠血浆抗Smith抗体水平显著升高；与野生型小鼠（WT）相比，WT_PtHx小鼠右心室收缩压（RVSP）、右心室肥厚指标（RV/LV+S）和肺指数显著升高，而KO_PtHx小鼠上述指标进一步升高。

HE染色显示WT_PtHx小鼠肺小动脉壁增厚，KO_PtHx小鼠肺血管重构更严重且出现新生血管；免疫荧光显示KO_PtHx小鼠肺小动脉中αSMA和Ki67阳性细胞（增殖平滑肌细胞）数量增加。

图2 TRAF5功能缺失在已建立的模型中加剧肺血管重构（PVR）

研究团队对WT_PtHx和KO_PtHx小鼠的肺组织进行单细胞RNA测序，获得17358个高质量细胞并将其注释为20种细胞类型，KO_PtHx组细胞组成与WT_PtHx组存在差异。TRAF5主要在动脉内皮细胞（ECs）和B细胞中表达，且KO_PtHx组这两种细胞中TRAF5mRNA表达均显著降低。

动脉内皮细胞中差异表达基因（DEGs）富集于ERK1/ERK2级联、p38MAPK级联和NIK/NF-κB信号通路，B细胞中DEGs富集于Toll样受体信号通路和淋巴细胞分化通路；KO_PtHx组动脉内皮细胞BMP信号活性降低，凋亡和炎症反应增强，B细胞活化增加。

进一步将内皮细胞分为TRAF5表达亚群和缺失亚群，发现830个显著差异基因。GO分析表明差异基因富集于炎症、细胞死亡和BMP信号通路。整体结果表明TRAF5是血管内皮中炎症、凋亡和发育信号的关键整合因子。

图3 TRAF5敲低后动脉内皮细胞凋亡增加

研究团队利用shRNA在人肺动脉内皮细胞（hPAECs）中敲低TRAF5，验证敲低效率后发现，与对照组（shScramble）相比，TRAF5敲低组（shTRAF5）组早期凋亡细胞比例显著增加。血管形成实验显示shTRAF5组细胞分支点数量和管长显著减少。划痕实验也表明shTRAF5组细胞迁移距离在24和42小时显著缩短。

对稳定转染的hPAECs进行RNA测序，鉴定出437个差异表达基因，GO分析显示上调基因富集于TGF-β刺激反应、结缔组织发育和血小板活化通路，下调基因富集于BMP信号通路和内皮细胞迁移，且shTRAF5组BMP4表达降低。

Westernblot显示TRAF5敲低后TRAF5、BMP4和pSMAD1/5/8蛋白表达降低，GDF8和pSMAD2/3表达升高，TGF-β表达无显著变化；

这些结果共同表明，TRAF5缺失通过扰乱BMP信号、增强TGF-β相关通路及炎症反应，导致肺动脉内皮细胞迁移、血管生成及抗凋亡能力显著受损，从而引发内皮功能障碍。

图4 TRAF5缺失诱导肺动脉内皮细胞（PAECs）功能障碍

免疫荧光三重染色显示WT_PtHx小鼠肺内皮细胞TRAF5表达显著低于野生型对照；为进一步验证TRAF5的作用，研究团队对SLE-PAH模型小鼠进行内皮特异性TRAF5过表达处理（AAV-ICAM2-TRAF5），并以载体对照（AAV-ICAM2-NC）作为比较。

结果显示与WT+PtHx组相比，PtHx+AAV-TRAF5组右心室收缩压（RVSP）、右心室肥厚指标（RV/LV+S）和肺指数显著降低。

HE和Masson三色染色显示PtHx+AAV-TRAF5组肺小动脉壁厚度和纤维化百分比显著低于WT+PtHx组；免疫荧光显示PtHx+AAV-TRAF5组肺小动脉中αSMA和Ki67阳性细胞数量减少，这些结果表明内皮特异性TRAF5过表达能够减轻肺血管重构，从而缓解SLE-PAH模型小鼠的肺动脉高压。

图5 内皮细胞特异性TRAF5过表达减轻系统性红斑狼疮合并肺动脉高压（SLE-PAH）模型中的血管重构

本研究揭示了TRAF5基因变异在系统性红斑狼疮合并肺动脉高压（SLE-PAH）中的关键致病作用，阐明了TRAF5功能缺失通过内皮功能障碍加剧SLE-PAH的分子机制及该基因作为治疗靶点的潜力。这一发现不仅深化了对SLE-PAH遗传机制与病理过程的理解，还为SLE-PAH的诊断生物标志物挖掘及靶向治疗方案开发提供了新的潜在策略。