摘要：2025年9月，来自四川大学华西医院的陈崇团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol to generate genetically engineered organoid-initiated mouse models of esopha

2025年9月，来自四川大学华西医院的陈崇团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol to generate genetically engineered organoid-initiated mouse models of esophageal cancer》的研究文章。本文提出了一种基于基因工程类器官的食管癌小鼠模型构建方案。

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摘要

Abstract

本文介绍了一种基于基因工程类器官的食管癌小鼠模型构建方案。研究描述了小鼠食管原代细胞的分离、类器官的培养、构建体和病毒的制备以及基因组编辑的步骤以及将工程类器官移植到食管、形成鳞状细胞癌和肿瘤发生监测的步骤。该方案较传统的基因工程小鼠模型建立速度更快。

#2

研究思路

Methods

首先从小鼠食管组织中分离原代上皮细胞，在Matrigel中形成类器官，并通过CRISPR/Cas9及病毒载体对其进行基因编辑，使其同时敲除抑癌基因Trp53、Pten、Smad4并过表达致癌基因cMyc、KrasG12D，以重现患者常见的关键基因异常组合。

随后将编辑后的类器官原位移植至小鼠贲门食管黏膜下层，借助生物发光成像监测肿瘤的植入及生长，最终获得与人类ESCC病理特征相似的原发性、原位、基因明确的肿瘤模型。

该策略整合类器官技术、基因编辑与原位移植，克服了传统基因工程小鼠模型构建周期长、成本高及定位难的问题，为研究食管癌的致病机制和验证靶向治疗方案提供了高效平台。

整个方案包含4个主要步骤：

1. 小鼠食管原代细胞分离

2. 小鼠食管类器官培养建立

3. 类器官基因编辑

4. 食管类器官原位移植

#3

实验设计

Design

下图是实验方案的示意图

一. 准备工作

该方案基于一种替代策略，即将基因编辑后的正常上皮类器官原位移植，以构建原发性、原位且具有明确遗传背景的肿瘤模型，称为类器官起始的精准癌症模型（Organoid-initiated Precision Cancer Model，OPCM）。这一策略可用于建立肺癌、膀胱癌、胃癌和子宫内膜癌模型。

从Trp53/Cas9小鼠中分离食管原代细胞，因为其同源人类基因TP53在食管癌中具有最高的突变频率。本方案还优化了类器官培养条件，以便进行后续的基因组编辑。

通常情况下，从一只小鼠的食管中可分离约10^6个细胞，在培养1周内即可形成100个以上类器官。经过1周的基因编辑后，可获得约500个类器官用于原位移植。小鼠在移植后约30天内即可形成原发性原位食管鳞状细胞癌。所有试剂和操作过程必须保持细胞培养级别的无菌条件，并严格注意个人防护。

二. 小鼠食管原代细胞分离

时间：每只小鼠约1-2小时

本步骤介绍如何利用酶解法从Trp53/Cas9小鼠（6–8周龄，雄性）中分离食管原代细胞。

食管组织解剖

在冰上或4°C冰箱中过夜融化10 mL Matrigel，分装500 μL/管于无菌1.5 mL离心管，置于-20°C保存。

通过颈椎脱臼法处死小鼠，将四肢固定仰卧，用70%乙醇喷洒腹面及操作区域。

从腹股沟至颈部切开进入腹腔，用剪刀切断颈椎、食管和气管。

将肝脏拨向一侧，显露胃部，沿胃上端找到食管，用弯镊夹住食管。

无菌解剖食管（在贲门处切断，去除前胃，约1 cm；图1A）。

沿食管腔纵向剪开，用预冷洗涤缓冲液快速冲洗。

将组织置于50 mL离心管内的新鲜预冷洗涤液中，置冰上备用。

注意：Matrigel全程保持在冰上，避免反复冻融。

关键：若颈部未充分切断食管和气管，可能导致组织破裂，影响样本完整性及后续细胞产量。

原代细胞分离

在冰上于另一50 mL离心管中准备10 mL消化液。

将食管组织置于无菌10 cm培养皿，用镊子固定。

在冰上用手术刀切碎组织直至无可见大块。

将组织用镊子转入消化液中，并用消化液冲洗剪刀残留组织一并收集。

置37°C摇床（120 rpm）消化60分钟。

加入30 mL室温消化终止液（25°C）停止消化反应。

将混合液通过70 μm滤网过滤。

400 g离心10分钟，弃上清。

用200 μL冰冷DMEM/F12重悬沉淀，使用台盼蓝计数细胞。

提示：若无摇床，可每10分钟手动摇动一次；或用37°C水浴，每10分钟倒置一次。

关键： 终止液体积较大有助于提高过滤流速，更多上皮细胞能通过滤网。弃去上清时，最后用200 μL移液枪操作以免吸走细胞沉淀。

图1

三. 小鼠食管类器官培养建立

时间：约30分钟

本步骤介绍如何将食管上皮细胞接种至Matrigel穹顶结构中培养形成类器官（图1C）。在分离的细胞混合物中，包含上皮细胞、基质细胞、免疫细胞等，但在所用培养基条件下，仅上皮细胞可继续增殖形成类器官，其余细胞无法生长。

类器官接种

使用前1小时在冰上解冻Matrigel；在37°C水浴中预热条件培养基。

将细胞悬液400 g 离心10分钟，弃上清。

在冰上用Matrigel重悬细胞并充分混匀。

将30 μL细胞/Matrigel混合液滴加到预热的48孔板中央。

将48孔板置于37°C培养箱孵育30分钟，使Matrigel固化。

固化后，每孔加入150 μL预热条件培养基，并在孔板边缘加500 μL DPBS防止培养基蒸发。

将类器官培养物置于37°C、5%CO₂、湿润培养箱中继续培养。

注意：重悬细胞时动作缓慢并保持吸头前端始终有液体，以避免产生气泡，气泡会影响类器官生长。

关键：确保每30 μL Matrigel中含1000-3000个原代细胞，过少细胞会导致培养效率低，过多则空间不足影响类器官正常发育（图1B）。

四. 基因组编辑

时间：约1-2周

本节介绍类器官培养维护、传代、构建制备、病毒感染及编辑效率验证等步骤。

类器官维持培养

每3天更换一次条件培养基。

每日用显微镜观察类器官生长情况，确保无污染并持续增大。当直径达200 μm或空间不足时需进行传代。

类器官传代

使用前1小时在冰上解冻Matrigel；37°C预热条件培养基。

弃去48孔板Matrigel穹顶中的培养基，用1 mL TrypLE吹打并刮取，收集所有类器官悬液至预冷无菌15 mL离心管。

置37°C摇床（120 rpm）孵育30分钟。

400 g离心10分钟，弃上清。

按1:6比例在冰上用Matrigel重悬并混匀，分装到48孔板。

孵育37°C 30分钟使Matrigel固化。

固化后，每孔加入150 μL预热条件培养基，孔板边缘加500 μL DPBS防止干燥。

将培养物置于37°C、5%CO₂、湿润培养箱中继续培养。

提示： 传代比例可根据需要调整：扩大培养可用1:3-1:6；若需观察形态，可稀释至约1:100。

载体构建及制备

从基因合成公司订购Pten、Smad4及对照Scramble gRNA寡核苷酸。

对引物进行磷酸化并退火。

用BsmBI（55°C，2 h）切割pLenti-U6-gRNA-EFS-mCherry载体，再用CIP（37°C，1 h）去磷酸化末端（图2A）。

柱纯化线性化载体，用T4 DNA连接酶将gRNA片段克隆入载体。

将连接产物转入DH5α感受态细胞并涂板：

a. 冰上混合5 μL连接产物+≥50 μL感受态细胞15 min，42°C热激30 s。

b. 冰上放置≥2 min后涂板，挑取阳性克隆制备质粒。

c. 用U6引物Sanger测序鉴定正确克隆。

6. 订购KrasG12D与cMyc全长cDNA（图2B）。

7. 用Phanta Flash高保真聚合酶PCR扩增cDNA，延伸加入15 bp同源臂，并用柱纯化。

8. 用EcoRⅠ与BglⅡ（37°C，2 h）切割pMSCV-iRES-luci2载体。

9. 柱纯化线性载体，用无缝克隆酶（50°C，30 min）将cDNA克隆入载体。

10. 将连接产物转入DH5α 感受态细胞并涂板：

a. 冰上混合5 μL连接产物+≥50 μL感受态细胞15 min，42°C热激30 s。

b. 冰上放置≥2 min后涂板，挑取阳性克隆制备质粒。

c. 用MSCV引物Sanger测序鉴定序列正确性。

11. 病毒制备

a. 转染前一天将293T细胞接种至6孔板，使密度达约90%。

b. 转染前更换含氯喹（终浓度25 μM）的新鲜培养基。

c. 以磷酸钙转染法混合：辅助质粒psPAX2 2 μg、pMD2.G 1 μg+靶gRNA质粒4 μg+12.5 μL 2 M CaCl₂，补足至100 μL。

d. 与等体积2×HBS溶液混匀后滴加入培养基，轻轻摇匀。

e. 另一组混合：辅助质粒pCL-Eco 0.5 μg、pCAG-VSVG 0.2 μg+靶cDNA质粒4 μg+12.5 μL 2 M CaCl₂，同法处理并滴加。

f. 转染8-12 h后更换培养基，于36 h、48 h、60 h收集上清，共得约6 mL病毒液。

注意：病毒应4°C保存并在1周内使用；需在二级生物安全实验室（BSL-2）操作。

类器官感染

弃去48孔板Matrigel穹顶中的培养基。

用1 mL TrypLE吹打刮取收集类器官悬液至预冷无菌15 mL离心管。

置于37°C 摇床（120 rpm）孵育30分钟。

400 g离心10分钟，弃上清。

将类器官沉淀重悬于1 mL 病毒混合液（Pten 250 μL+Smad4 250 μL+cMyc 250 μL+KrasG12D 250 μL）。

将混合液转入12孔板，在31°C下400 g离心60分钟。

将板置于37°C湿润5%CO₂培养箱孵育12 h。

收集细胞悬液至15 mL离心管，400 g离心10分钟后按传代步骤重新接种类器官。

提示：使用含1 μg/mL嘌呤霉素的条件培养基筛选阳性类器官，持续1周（图2C）。

编辑效率验证

对编辑后的类器官，弃去培养基，用500 μL TNES缓冲液+3 μL 蛋白酶K（20 mg/mL）重悬于1.5 mL EP管，55°C加热2 h。

加500 μL异丙醇混匀颠倒，可见白色絮状沉淀，10000 g离心10分钟。

弃上清，加入1 mL 75%乙醇悬浮沉淀，4°C 12000 g离心5分钟。

弃上清，25°C 晾干残液后用20 μL无核酸酶水重悬沉淀。

对gRNA靶向片段进行PCR扩增并用F引物Sanger测序（图2D）。

另取编辑类器官，弃去培养基后用1 mL TRIzol（25°C）重悬5分钟。

加200 μL氯仿轻轻颠倒混匀，4°C 10000 g离心15分钟。

转移上层水相至新EP管，加500 μL异丙醇反复摇匀，25°C静置10分钟后再4°C 10000 g离心15分钟。

弃上清，加入1 mL 75%乙醇混匀沉淀，4°C 12000 g离心5分钟。

弃上清，25°C晾干残液后用20 μL无核酸酶水重悬沉淀。

使用HiScript II Q RT-qPCR试剂盒按说明书将RNA逆转录为cDNA。

最后进行qPCR评估cDNA扩增效率（图2E）。

提示：普通类器官与成功编辑类器官在短期内形态差异不明显，建议通过荧光检测及基因突变效率进行鉴定。

图2

五. 建立原位食管癌小鼠模型

时间：约2个月

本节介绍原位移植手术及体内活体成像监测步骤。受体小鼠需为BALB/cA-nu，年龄≥6周，性别不限。

原位移植手术

用TrypLE收集足量类器官（每只小鼠约2×10⁵-5×10⁵个细胞，或2-4个孔的类器官）。

将编辑后的类器官用PBS与Matrigel按1:1混合后重悬，总体积20 μL，置冰上备用，但不超过2小时。

使用异氟烷麻醉受体小鼠。

用胶带固定四肢，使小鼠仰卧。

用70%乙醇喷洒小鼠腹面及操作区。

在小鼠左侧肋下缘处切开0.5 cm切口进入腹腔：

a. 将肝脏拨向一侧，显露胃部。

b. 轻轻夹住胃部，用镊子定位食管，在胃食管交界处，从胃侧向食管方向插入针头。

c. 将针头定位在距食管出口约3 mm处。

d. 确保针头平行食管，置于肌层与黏膜层之间，插入深度约3 mm。

e. 用胰岛素针向食管黏膜内注射约20 μL细胞悬液（图3A）。

7. 立即缝合切口。

8. 移植20天后使用D-luciferin成像系统监测肿瘤生长（图3B）。

注意：建议选用≥8周龄小鼠，因过年龄过小的小鼠食管过薄，手术操作困难。裸鼠与C57BL/6均可作受体，但裸鼠20天左右即可成瘤，而C57BL/6约需40天。成瘤监测时间受类器官编辑效率、活性及移植成功率影响。在我们的TPSCK模型中，约20天后可检测到荧光信号，并可持续约60天。实验终点定义为因肿瘤导致死亡或因食管梗阻导致体重降至

图3

#4

预期结果

Results

本研究建立了一套原发性、原位且具有明确遗传背景的肿瘤模型构建方案。该方案包括：分离小鼠食管原代细胞、建立食管类器官培养体系、进行类器官基因组编辑及原位移植。

嵌入Matrigel的食管上皮细胞最终发育成具有特征性“草帽样”形态的中间角化型类器官，再现了小鼠食管组织中观察到的中度角化及周围干细胞增殖特征，也与人类食管类器官的病理表现一致。

在ESCC患者队列中，常见的基因组事件包括：抑癌基因TP53、PTEN和SMAD4的功能缺失（缺失或突变），以及MYC与KRAS的拷贝数扩增。基于此推测联合破坏这些基因可能驱动肿瘤发生。

为验证这一假设，研究者从Trp53/ROSA-CAG-Cas9-iRES-eGFP小鼠中分离原代食管细胞并建立类器官培养。随后通过共表达mCherry的慢病毒载体敲除Pten与Smad4，并利用携带荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体实现cMyc和KrasG12D过表达。

通过Sanger测序验证抑癌基因敲除效率，并用qPCR检测癌基因过表达水平。由于小鼠食管壁较薄且胸段食管手术暴露困难，研究者将基因编辑后的TPSCK类器官（Trp53-/-；sgPten；sgSmad4；cMyc；KrasG12D）原位移植至胃食管交界处的食管黏膜层。

D-荧光素生物发光成像证实移植物在移植部位稳定存活并持续生长。肉眼观察发现，移植物可完全占据胃食管交界处。组织病理学分析显示其具有典型的ESCC组织学特征，免疫组化进一步证实其表达 鳞状细胞癌标志物TP63、KRT5、KRT13、KRT14（图3C-E）。

实验仪器和材料

局限性

本方案建立了一种从小鼠食管组织分离原代细胞并培养类器官的方法。然而，由于食管通过口腔与外界相通且并非无菌环境，在操作过程中难免出现细菌或真菌污染。一旦发生污染，必须及时处理以防止其进一步扩散。

在ESCC患者中，食管鳞状细胞癌多发生于食管上段和中段。但由于手术操作难度较大，本模型难以完全模拟这些主要发病部位。小鼠食管较细窄，一旦肿瘤形成，易引起食管梗阻，导致营养不良甚至死亡。

此外，由于ESCC中基因突变频率高且患者间突变组合复杂，目前的策略只能模拟部分可能的突变组合并研究特定基因功能，仍与患者真实情况存在差距。

另外，食管癌中大段染色体片段的缺失和扩增远多于单基因突变或功能缺失，但由于人鼠两种生物间染色体结构差异明显，本模型难以再现这些染色体改变对食管癌发生发展的影响。

Q1

在类器官培养、传代及感染过程中，Matrigel小穹顶内出现气泡，影响类器官发育

解决方案：气泡主要由吹打过度引起。当用Matrigel重悬类器官时，如果吸头内液体被完全推出，空气就会混入。建议在吹出时保留少量液体，以防止空气进入Matrigel中。

Q2

类器官培养或传代过程中，Matrigel小穹顶塌陷，导致类器官发育不良

解决方案：主要原因是在重悬类器官时残留胰蛋白酶或TrypLE未清除干净。可在重悬前使用200 μL吸头将残余酶液彻底吸除，以避免Matrigel结构受损。

Q3

感染后类器官生长缓慢或发生凋亡

解决方案：主要原因是病毒滴度过高或感染孵育时间过长。可通过用培养基稀释病毒或缩短感染时间来改善类器官存活率和生长情况。

Q4

手术过程中类器官无法准确移植到食管肌层与黏膜层之间

解决方案：腹部切口位置错误，未能准确暴露贲门食管。应在左侧肋缘下方切口以便进入腹腔并暴露目标部位。胰岛素针注射角度或位置不正确，误刺入食管腔导致类器官无法定植。应将针头与食管平行约3 mm深插入，避免刺破食管包膜，并轻轻旋转针头以确保未进入食管腔。

Q5

基因编辑后的类器官在原位移植后未能形成肿瘤

解决方案：移植时类器官数量不足或活性不佳。需每只小鼠至少移植2×10⁵个活性细胞。使用嘌呤霉素筛选可提高编辑类器官的纯度与效率。手术过程中若类器官泄漏至腹腔也会导致成瘤失败，可在体视显微镜辅助下进行移植以提高精确度。

参考文献

Wang J, Du J, Luo X, et al. Protocol to generate genetically engineered organoid-initiated mouse models of esophageal cancer. STAR Protoc. 2025;6(3):104028. doi:10.1016/j.xpro.2025.104028

来源：培养盒守护者