摘要：CAR-T细胞攻击表达靶抗原的非肿瘤细胞造成的“在靶脱肿瘤”（On target off tumor）效应是阻碍CAR-T治疗血液肿瘤或实体瘤临床实践的关键障碍，是造成CAR-T细胞引发严重器官损伤的重要原因之一。目前临床上处理该不良反应主要通过大剂量激素，或
CAR-T细胞攻击表达靶抗原的非肿瘤细胞造成的“在靶脱肿瘤”（On target off tumor）效应是阻碍CAR-T治疗血液肿瘤或实体瘤临床实践的关键障碍，是造成CAR-T细胞引发严重器官损伤的重要原因之一。目前临床上处理该不良反应主要通过大剂量激素，或给CAR-T细胞装配安全开关，但上述方法都会大幅度损伤CAR-T细胞的抗肿瘤疗效。深入解析on target off tumor毒性的精确机制，将有助于建立新型干预策略。
近日，徐州医科大学细胞治疗药物产业学院施明教授，郑骏年教授团队利用人Her2转基因小鼠和靶向人Her2的小鼠CAR-T细胞构建了CAR-T细胞致免疫健全小鼠急性肺损伤的研究模型，揭示了靶向Her2的CAR-T细胞造成急性肺损伤的分子调控机制，并有针对性地提出了预防该不良反应的策略。该研究成果于2025年3月20日发表于Molecular Therapy。
图片来源：《Molecular Therapy》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40119519/）
研究材料与方法
在该研究中，研究人员利用靶向Her2的小鼠CAR-T细胞攻击Her2转基因小鼠作为动物模型，使用CAR-T细胞攻击过表达Her2的小鼠I型肺泡上皮细胞系MLE12-Her2深入探究了CAR-T细胞造成急性肺损伤的分子机制。同时采用在CAR-T细胞攻击过程中加入IFN-γ中和抗体，以及使用Prf基因敲除鼠，Gzmb基因敲除鼠（由赛业生物提供）来源的腹膜淋巴结制备CAR-T细胞，以分别探究IFN-γ，Prf和GzmB在CAR-T细胞致急性肺损伤中发挥的不同功能。根据阐明的机制，研究者还提出了在CAR-T细胞输注同时中和IFN-γ的不良反应对抗策略，并在动物模型中进行验证。
技术路线
01 利用Her2转基因小鼠模型，评估CAR-T细胞造成急性肺损伤的特征
02 建立体外模型探究CAR-T细胞致急性肺损伤的分子机制
03 探究IFN-γ，Prf和GzmB在CAR-T细胞致急性肺损伤中发挥的不同功能
04 在动物模型中验证中和IFN-γ对抗急性肺损伤防控策略的可行性
研究结果
1 Her2 CAR-T细胞直接攻击小鼠肺造成肺损伤
为了模拟CAR-T细胞引起的急性肺损伤，研究者将Her2-CAR-T细胞输注小鼠的血液循环中。注射后6小时，采集肺部进行HE染色。结果显示，Her2 CAR-T细胞靶向Her2转基因小鼠的肺部，导致充血、肺泡间隔弥漫性增厚、肺泡结构恶化和炎性细胞浸润等病理变化（图1a），并且造成肺部渗出增加（图1b）。这些结果表明，Her2-CAR-T细胞对肺组织的攻击具有靶点特异性。此外，注射到循环系统中的Her2-CAR-T细胞主要积聚在肺部，（图1c-d）。CAR-T细胞的这种分布特征可能部分解释了其造成急性肺损伤的必然性。Western Blot结果表明，由于CAR-T细胞攻击的肺部中的切割，凋亡相关蛋白Caspase 3和Caspase 7被激活（图1e）。因此，研究人员认为Her2-CAR-T细胞通过直接靶向小鼠肺泡上皮细胞，导致以凋亡为特征的急性肺损伤。
图1 CAR-T细胞造成小鼠急性肺损伤[1]
2 Caspase 7在CAR-T细胞对肺泡上皮细胞的损伤中起保护作用
为了研究CAR-T细胞诱导的肺损伤的内在分子机制，研究人员建立了Her2-CAR-T细胞攻击小鼠I型肺泡上皮细胞系MLE12-Her2的体外模型（图2a）。CAR-T细胞攻击导致MLE12-Her2细胞中Caspase 3和7的切割（图2b），这与体内现象一致。值得注意的是，CAR-T细胞诱导的Caspase 7切割导致全长Caspase 7水平显著降低（图2b）。因此，研究人员猜测Her2 CAR-T细胞攻击可能在介导靶细胞Caspase 7的切割，同时下调Caspase 7蛋白的表达。在此基础上，研究者探究了Caspase 7在CAR-T细胞诱导的急性肺损伤中的作用。
研究人员使用AAV腺病毒敲低小鼠肺部Caspase 7表达后（图2c）使用CAR-T细胞攻击，结果表明Caspase 7敲除小鼠经历了更严重的肺损伤（图2d）。这表明Caspase 7在CAR-T细胞诱导的肺损伤中起着保护作用，其表达减少可能会加剧这种损伤。为了进一步证实Caspase 7在CAR-T细胞攻击中的作用，研究人员构建了Caspase 7敲除或过表达的MLE12-Her2细胞，并用两种荧光染料标记，以评估CAR-T细胞的细胞毒性作用（图2e）。结果显示，与MLE12-Her2Caspase 7 KO靶细胞相比，MLE12-Her2Caspase 7OE细胞在CAR-T细胞攻击下表现出更高的存活率和更低的凋亡水平（图2e）。这些发现均说明，Caspase 7在CAR-T细胞攻击肺泡上皮细胞的场景中起保护作用。
图2 CAR-T细胞介导靶细胞Caspase 7下调加重肺损伤[1]
3 CAR-T细胞主要通过IFN-γ而不是Prf-GzmB系统引起急性肺损伤
众所周知，CAR-T细胞主要通过分泌IFN-γ，以及释放穿孔素和颗粒酶造成靶细胞损伤。因此研究者在CAR-T细胞攻击过程中加入IFN-γ中和抗体，以及使用Prf基因敲除小鼠，Gzmb基因敲除小鼠（由赛业生物提供）来源的腹膜淋巴结制备CAR-T细胞，以分别探究IFN-γ，Prf和GzmB在CAR-T细胞致急性肺损伤中发挥的不同功能。令人惊讶的是，IFN-γ、Prf和GzmB在诱导靶细胞死亡方面显示出不同的机制。研究结果表明，中和IFN-γ可有效地对抗了CAR-T细胞的细胞毒性，但使用Prf KO的Her2-CAR T细胞或GzmB KO的Her2-CAR T细胞仍能造成靶细胞的损伤（图3a-c）。同样，在体内实验中，Her2-CAR TPrf KO细胞和Her2-CAR TGzmB KO细胞造成的肺损伤与野生型Her2-CAR-T细胞造成的损伤相当。然而，在CAR-T细胞攻击期间同时给予IFN-γ中和抗体显著减轻了CAR-T细胞诱导的肺泡壁增厚和水肿（图3d和）。这些结果表明，CAR-T细胞诱导的急性肺损伤主要由IFN-γ介导。
图3 中和IFN-γ可逆转CAR-T细胞造成的急性肺损伤[1]
4 在CAR-T细胞输注过程中中和IFN-γ可以改善急性肺损伤，但不会损害抗肿瘤疗效
在明确了IFN-γ在CAR-T细胞造成急性肺损伤过程中的核心作用后，研究者提出了在CAR-T细胞输注的同时给与IFN-γ中和抗体的不良反应防控策略。研究结果表明，输注的中和抗体能够显著抑制CAR-T细胞输注12-24小时内小鼠血清中IFN-γ的分泌高峰，但是不影响最终抗肿瘤的效应（图4）。
图4 中和IFN-γ可防止CAR-T细胞造成的急性肺损伤，但不影响抗肿瘤功能[1]
研究结论
本研究明确了CAR-T细胞直接攻击小鼠肺组织，造成以肺间质水肿为特征的急性肺损伤。在微观层面，CAR-T细胞的攻击主要造成I型肺泡上皮细胞的凋亡，研究进一步证实这些损伤主要由IFN-γ介导。并且，本研究还揭示了CAR-T细胞释放的IFN-γ通过诱导Caspase 7 mRNA 5’UTR降解，下调Caspase 7表达水平，进而加重肺损伤的分子调控机制。在此基础上，本研究提出了在CAR-T细胞输注的同时给与IFN-γ中和抗体对抗肺损伤，但不影响CAR-T细胞后续抗肿瘤功能的不良反应防控策略，并在动物实验的水平证明了该策略的可行性。这些研究结果为临床试验中制定针对CAR-T细胞疗法在靶脱肿瘤毒性的防控策略提供了坚实的理论基础。
参考文献：
[1]Hou R, Zhang X, Zhang Z, He W, Li H, Wang X, Zhao X, Li S, Guan Z, Sun Y, Liu D, Zheng J, Shi M. IFN-γ-mediated suppression of Caspase 7 exacerbates acute lung injury induced by CAR-T cells. Mol Ther. 2025 Mar 20:S1525-0016(25)00197-2. doi: 10.1016/j.ymthe.2025.03.023. Epub ahead of print. PMID: 40119519.
来源：赛业生物