摘要：近期，加州大学圣塔芭芭拉分校（University of California Santa Barbara）杨扬教授联合匹兹堡大学（University of Pittsburgh）刘鹏教授，报道了一种光酶协同催化与多酶级联催化反应，用于对映选择性制备多取代的
导读：
近期，加州大学圣塔芭芭拉分校（University of California Santa Barbara）杨扬教授联合匹兹堡大学（University of Pittsburgh）刘鹏教授，报道了一种光酶协同催化与多酶级联催化反应，用于对映选择性制备多取代的非天然脯氨酸。通过对吡哆醛脱羧酶（UstD）进行功能重构和定向进化，利用光酶协同催化策略，在可见光照射下，将天冬氨酸与 α-卤代酮进行立体选择性C-C键偶联，生成环状亚胺。随后串联使用亚胺还原酶（cpIRED），立体选择性还原环状亚胺实现了一系列的非天然多取代脯氨酸的合成。相关研究成果于2025年9月25日在线发表于Nature Chemistry 杂志。通讯作者为杨扬教授和刘鹏教授, 论文的第一作者为张晨博士。
自从2023年以来，杨扬教授课题组通过生物催化与光氧化还原催化的协同作用，首先提出并且实现了吡哆醛（PLP）酶的功能重构，将多种闭壳层机制的吡哆醛酶改造成自由基酶，实现了多类分子间不对称自由基偶联反应。（参见课题组前期工作: Science 2023, 381, 444, 点击阅读详细; Nature 2024, 629, 98, 点击阅读详细; Science 2025, DOI: 10.1126/science.adx2935, 点击阅读详细 ）。在本工作中，作者通过重新利用磷酸吡哆醛（PLP）依赖性天冬氨酸β-脱羧酶（UstD），设计了一种光生物催化的脱羧C-C键偶联与亚胺还原酶（IRED）级联反应。该策略利用PLP酶特有的β-活化机制，实现了天冬氨酸的选择性β-脱羧，形成烯胺中间体，结合光氧化还原催化产生的自由基中间体，构建了PLP酶催化氨基酸转化的自由基参与的新途径，进而合成具有脯氨酸骨架的氮杂环非天然氨基酸。随后，通过对宏基因组IRED的高通量筛选，获得了能够高选择性控制多手性中心的亚胺还原酶（cpIRED），实现了动态动力学不对称转化（DyKAT），最终制备出含多达三个立体中心、具有2,5-anti构型的多取代非天然脯氨酸。这些产物是传统化学或生物方法难以获得的，为自由基生物催化和非天然氨基酸合成开辟了新途径。
图1. 吡哆醛脱羧酶自由基生物催化
作者以天冬氨酸和α-卤代苯乙酮为模型底物，磷酸吡哆醛（PLP）依赖性天冬氨酸β-脱羧酶（UstD）为酶催化剂，在光催化剂Ru(bpy)3Cl2作用下实现了高对映选择性的自由基C-C偶联，生成环状亚胺产物4a。进一步通过对UstD酶的改造，获得催化活性显著提高的突变体UstD L392G，命名为AfPLPβ。随后，环状亚胺4a的还原，多数化学方法均可获得还原产物5a，但立体选择性均较差。使用PtO2/H2还原时，可以94:6的选择性得到2,5-syn构型的产物5a-dia。而通过宏基因组IRED高通量筛选，发现cpIRED可高效、专一性地生成2,5-anti构型产物5a。从易得底物出发，通过对光催化剂的筛选，PLP脱羧酶的改造，IRED的开发，作者建立了光酶协同催化与多酶级联催化（Ru(bpy)3Cl2 + AfPLPβ + cpIRED + GDH-001）一锅法高效高立体选择性合成非天然脯氨酸的新策略。
图2. 光酶协同催化合成非天然脯氨酸的发现与优化
该方法展现出广泛的底物适应性，能够耐受多种取代基。例如：甲基取代物（5b-5d，产率可达 73%）、卤素取代物（5e-5g，42-68% 产率）、供电子基团取代物（5j-5k，42-55% 产率）、吸电子基团取代物（5m-5q，35-71% 产率），以及含氟脯氨酸衍生物 5s 和烷基取代脯氨酸衍生物 5t，都能够以较高产率顺利制备。更为重要的是，在本研究考察的所有底物中，所得非天然脯氨酸产物均表现出高度一致且优异的立体选择性。这一结果凸显了在该级联生物催化体系中，天冬氨酸β-脱羧酶（AfPLPβ）与亚胺还原酶（cpIRED）不仅具备广泛的底物兼容性，而且能实现卓越的立体控制，从而为非天然脯氨酸及其衍生物的合成提供了一种温和、高效且普适的策略。
图3. 光酶催化 C-C 偶联与 IRED 催化亚胺还原的底物范围
该光酶协同催化C-C键偶联反应亦可兼容α-支链卤代酮底物，生成三取代的环状亚胺产物4u。但由于γ-位的快速差向异构化，使得产物4u为d.r. 1:1的混合物。作者通过高通量实验重新筛选了 IRED 酶库，仅有少数IRED 在亚胺 4u 的还原中表现出不同程度的催化活性。在这些酶中，cpIRED 依然是活性最高、立体选择性最优的生物催化剂，通过 DyKAT（动态动力学不对称转化）过程能够以 97% 的收率进行，并获得 96:4:0 的非对映选择性，制备出含三个立体中心、具有2,5-anti构型的非天然脯氨酸5u。此外，这种 IRED 催化的 DyKAT 同样适用于由环状 α-卤代酮衍生得到的双环亚胺转化，5v、5w 、5x和5y都能顺利转化，生成相应的三环非天然氨基酸产物。
图4. 级联光生物催化偶联和IRED催化DyKAT的开发与底物范围
作者通过百毫克级规模反应证明了方法的实用性，并通过不同的还原条件，实现了产物亚胺4a的多样化转化：cpIRED还原得到5a (99%产率，d.r. >19:1；e.r. >99:1)，PtO2/H2化学还原得到5a-dia(86%产率，d.r. 94:6；e.r. >99:1)，Pd/C和H2还原得到开链产物6a (99%产率，e.r. > 99:1)。最后，作者通过对 5a 的酰胺衍生物 7a 进行单晶 X 射线衍射分析，进一步确认了其相对和绝对构型。
图5. 亚胺的转化
通过自由基捕获实验，作者证实α-羰基自由基9的存在。通过DFT计算研究表明： PLP 结合的烯胺中间体 8具有很强的亲核性，可快速、高区域选择性地与光氧化还原反应生成的亲电性 α-羰基自由基9 发生偶联；随后，α-自由基 11 经由 Ru(bpy)33+氧化为酮亚胺中间体 12，这一步强烈放热，提供了足够的热力学驱动力，促进电子从 11 向光敏剂转移。最后，保守的赖氨酸残基 K258 在反应循环中发挥多重作用：它既参与 PLP C4’ 的脱质子步骤（TS-1），又负责 Cα 的再质子化（TS-2），最终生成新的外部亚胺 14，并在随后的亚胺交换过程中释放出目标非天然氨基酸产物。计算结果揭示了 K258 的独特作用—它能够促进多个质子转移事件，从而通过 (Re)-面选择性的Ca质子化（TS-2），确保了产物的高对映选择性。这一赖氨酸驱动的脱质子-再质子化机制，是实现非天然氨基酸对映控制合成的关键。
图6. PLP酶催化β-脱羧自由基C-C偶联的计算研究
总结
本研究通过对 β-脱羧类 PLP 酶的功能重构和定向改造，建立了一种全新的吡哆醛自由基生物催化模式，实现了此前在有机化学与酶学中均未见报道的分子间自由基 C-C 偶联转化。该体系利用光-酶协同催化，将光氧化还原生成的自由基中间体与 PLP 酶催化形成的烯胺中间体高效耦合，为新型自由基反应的理性设计和拓展提供了平台。同时还发现了具有高立体选择性的 IRED 酶，成功合成了一系列非天然脯氨酸产物。这类环状非天然氨基酸含有两个至三个手性中心，展现出优异的非对映选择性和对映选择性。更为重要的是，本研究证明了吡哆醛自由基生物催化具有跨越不同 PLP 酶家族的普适性，拓宽了非天然氨基酸的合成边界，使得一类传统化学与常规生物催化均难以获得的分子成为可能。该成果不仅丰富了生物催化的反应类型，也为复杂手性氨基酸及其衍生物的绿色合成提供了全新思路与策略。
A pyridoxal radical carboligase and imine reductase photobiocatalytic cascade for stereoselective synthesis of unnatural prolines
Chen Zhang, Jun Zhou, Binh Khanh Mai, Zijun Qin, James Finnigan, Samantha Gittings, Peng Liu & Yang Yang
Nat. Chem., 2025, DOI: 10.1038/s41557-025-01937-2
研究团队简介
杨扬教授是加州大学圣芭芭拉分校(UCSB)化学与生物化学系副教授。课题组集中于生物催化、酶的改造、酶的设计以及有机化学研究，探索传统化学难以实现的酶催化反应、发展高效的蛋白质催化剂。课题组首次提出并发展了 Metalloredox Radical Biocatalysis（Science 2021, 374, 1612）、Pyridoxal Radical Biocatalysis（Science 2023, 381, 444; Nature 2024, 629, 98; Science 2025, 389, eadx2935）的新型酶催化模式，创造了新酶功能、包括传统酶学及合成化学均未知的全新酶功能，用于解决合成化学以及不对称催化中存在的问题。
刘鹏教授是匹兹堡大学化学系理查德•梅隆讲席教授。刘鹏教授课题组运用多种计算化学工具和机器学习模型对酶催化和有机催化反应机理进行研究，长期致力于催化反应活性和选择性的预测和计算机辅助催化剂设计。在生物催化领域，刘鹏教授课题组采用分子动力学和量子化学结合的方法研究了多种酶催化反应的机理以及立体选择性控制。
张晨博士，本科毕业于四川大学，2019年于四川大学华西药学院获得药物化学硕士学位（导师：吴勇教授，研究方向为药物活性小分子的合成和开发）。2022年于四川大学生物治疗国家重点实验室获得生物化学博士学位（导师：钮大文教授，研究方向为糖化学/糖苷键的立体选择性构建）。同年加入UCSB杨扬教授课题组，目前主要研究光酶协同催化，开发新反应与新转化以及发展天然酶的新功能。至今以第一作者身份（含共同）在Science，Nat. Chem. (2篇)，Nat. Synth.，Angew. Chem. Int. Ed. 上发表多篇论文。
来源：X一MOL资讯
