摘要：多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）作为第二大血液系统恶性肿瘤，其治疗格局在 CAR-T 疗法出现后迎来革命性变化。以BCMA（B 细胞成熟抗原）靶向 CAR-T为例，这类疗法对复发 / 难治性 MM 患者的客观缓解率（ORR）可达 70%
多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）作为第二大血液系统恶性肿瘤，其治疗格局在 CAR-T 疗法出现后迎来革命性变化。以BCMA（B 细胞成熟抗原）靶向 CAR-T为例，这类疗法对复发 / 难治性 MM 患者的客观缓解率（ORR）可达 70%-90%，部分患者甚至实现微小残留病（MRD）阴性，一度被视为 “治愈” MM 的希望。然而，临床数据显示，约 50%-60% 的患者在接受 BCMA-CAR-T 治疗后 1-2 年内会出现疾病复发，而复发的核心根源在于 ——CAR-T 细胞在患者体内的长期存活能力（即 “持久性”）不足。
CAR-T 细胞的持久性是决定疗效的关键指标：若 CAR-T 能在体内持续存活并维持效应功能，就能实时清除残留的肿瘤细胞，防止复发；反之，若 CAR-T 在短期内发生增殖停滞、凋亡或功能耗竭（表现为 PD-1、LAG-3 等耗竭标志物高表达），则肿瘤细胞会迅速 “卷土重来”。此前研究虽尝试通过优化 CAR 结构（如引入共刺激分子 4-1BB、CD28）、联合免疫检查点抑制剂等方式提升持久性，但效果有限 —— 这些策略多针对 CAR-T 与肿瘤微环境的 “外在互作”，却忽视了CAR-T 细胞自身内在基因对其存活与功能的调控。
正是在这一背景下，美国纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心（MSKCC）与德国慕尼黑大学团队联合开展研究，通过体内 CRISPR-Cas9 功能丧失筛选，系统性寻找限制 CAR-T 细胞持久性的 “内在基因靶点”，最终锁定 CDKN1B（编码 p27^Kip1 蛋白）为核心调控因子。该研究以 “精准定位内在限制因子、直接优化 CAR-T 细胞自身属性” 为突破口，为解决 CAR-T 持久性难题提供了全新策略，相关成果发表于《Nature》（doi:10.1038/s41586-025-09489-8）。
明确且聚焦的科学问题是研究成功的前提：哪些内在基因通过时间依赖性、环境依赖性的调控，限制了 CAR-T 细胞在体内的长期存活（持久性）与抗肿瘤功能？
这一问题的设计暗含两个关键考量：
时间维度：CAR-T 细胞在体内的生命周期分为 “早期扩增期”（注射后 1-2 周，大量增殖以清除肿瘤）、“中期稳定期”（2-4 周，维持数量与功能）、“晚期衰退期”（4 周后，数量下降、功能减弱），不同阶段可能由不同基因调控；环境维度：体外培养环境（营养充足、无肿瘤微环境抑制）与体内生理环境（营养竞争、肿瘤微环境中的免疫抑制分子如 TGF-β、IL-10）存在显著差异，仅通过体外筛选无法模拟体内真实情况，需建立 “体内筛选模型”。研究团队遵循 “构建文库→体内筛选→锁定靶点→验证功能” 的严谨逻辑，设计了一套可追踪、高分辨率的筛选体系，具体流程如下：
为避免全基因组文库的筛选噪音，团队选择 “免疫细胞功能与存活相关基因” 作为靶点，构建了包含1,200 个候选基因（涵盖细胞周期调控、信号通路、凋亡、代谢等通路）的 CRISPR 敲除文库，每个基因设计 3-5 条 sgRNA（确保敲除效率）。同时，将表达 Cas9 的 BCMA-CAR-T 细胞（靶向 MM 细胞表面的 BCMA 抗原）与该 sgRNA 文库慢病毒共转染，获得 “混合 CAR-T 细胞池”—— 每个 CAR-T 细胞携带 1 个基因的敲除，且通过 sgRNA 序列可追溯其敲除的基因。
选择 MM 研究中常用的NSG 免疫缺陷小鼠（无 T、B、NK 细胞，可容纳人源 CAR-T 与 MM 细胞），通过尾静脉注射人 MM 细胞系（MM.1S，高表达 BCMA）构建 “荷瘤小鼠模型”；待小鼠外周血中可检测到 MM 细胞（约 7 天后），再尾静脉注射上述 “混合 CAR-T 细胞池”，模拟临床治疗场景。
为解析不同时间点的基因功能，团队在 CAR-T 注射后3 个关键时间点收集小鼠外周血、骨髓（MM 主要定植部位）中的 CAR-T 细胞，通过高通量测序检测 sgRNA 的丰度变化：
早期（注射后 7 天，扩增期）：sgRNA 丰度升高→对应基因敲除后促进 CAR-T 早期增殖；中期（注射后 14 天，稳定期）：sgRNA 丰度维持稳定→对应基因敲除后不影响 CAR-T 存活；晚期（注射后 28 天，衰退期）：sgRNA 丰度显著升高→对应基因敲除后显著提升 CAR-T 晚期持久性。通过对比不同时间点的 sgRNA 丰度差异，团队初步筛选出 “体外扩增相关基因”“体内早期增殖相关基因”“体内晚期持久性相关基因” 三类候选基因。
对筛选出的候选基因，团队通过 “单独构建 sgRNA-CAR-T 细胞”（而非混合池），在体外与体内模型中逐一验证功能：
体外实验：检测 CAR-T 细胞的增殖速率（CCK-8 法）、凋亡率（Annexin V/PI 染色）、细胞因子分泌（IFN-γ、TNF-α，ELISA 法）；体内实验：检测 CAR-T 细胞在小鼠体内的存活时间（流式细胞术追踪）、肿瘤负荷（流式检测骨髓 MM 细胞比例）、小鼠生存率（ Kaplan-Meier 曲线）。最终证实：CDKN1B 是唯一在 “体内晚期持久性” 与 “抗肿瘤疗效” 中均表现出显著调控作用的基因，是限制 CAR-T 细胞长期存活的核心因子。
三、核心发现：基因调控的 “时间特异性” 与 CDKN1B 的关键作用研究团队通过分层筛选，揭示了不同基因在 CAR-T 细胞生命周期中的 “时间特异性功能”，其中 CDKN1B 的作用最为突出。
（一）体外筛选：RASA2 与 SOCS1 是 CAR-T 扩增的 “加速器”在体外培养体系中（含 BCMA 抗原刺激，模拟肿瘤识别），敲除RASA2或SOCS1的 CAR-T 细胞表现出显著的增殖优势：
增殖速率：较对照组（未敲除 CAR-T）提升 2.1-2.5 倍，培养 7 天后细胞数量可达对照组的 3 倍；凋亡率：较对照组降低 40%-50%，且细胞形态更饱满，无明显衰老特征（β- 半乳糖苷酶染色阴性）；功能增强：IFN-γ 与 TNF-α 的分泌量分别提升 1.8 倍与 1.5 倍，对 MM 细胞的杀伤效率（LDH 释放法）提升 60%。机制上，RASA2 是 Ras-MAPK 信号通路的 “负调控因子”（通过水解 Ras-GTP 为 Ras-GDP 抑制通路激活），敲除后 Ras-MAPK 通路持续激活，促进 CAR-T 细胞从 G1 期进入 S 期，加速增殖；SOCS1 则是 JAK-STAT 信号通路的 “负反馈抑制剂”（通过结合 JAK 激酶阻断 STAT 磷酸化），敲除后 STAT3/STAT5 持续激活，增强 CAR-T 细胞的效应功能与抗凋亡能力。
但需注意：当将这两种敲除型 CAR-T 细胞注入荷瘤小鼠体内后，其优势仅在早期（7 天内）显现，14 天后细胞数量便迅速下降，与对照组无显著差异 —— 提示 RASA2 与 SOCS1 仅调控 CAR-T 的 “体外扩增” 与 “体内早期增殖”，无法提升长期持久性。
（二）体内早期筛选：PTPN2、ZC3H12A、RC3H1 调控 CAR-T “初始存活”在荷瘤小鼠体内早期（注射后 7-14 天），敲除PTPN2、ZC3H12A或RC3H1的 CAR-T 细胞表现出更强的存活能力：
细胞数量：骨髓中 CAR-T 细胞比例较对照组提升 1.6-1.8 倍，且外周血中 CAR-T 细胞的循环时间延长 3-5 天；肿瘤抑制：小鼠骨髓 MM 细胞比例较对照组降低 30%-40%，但 14 天后肿瘤负荷再次上升。这三个基因的功能各有侧重：
PTPN2：一种酪氨酸磷酸酶，可通过去磷酸化 TCR 信号通路中的 Lck、ZAP70 蛋白抑制 T 细胞活化，敲除后增强 CAR-T 细胞对 BCMA 抗原的敏感性，提升初始活化效率；ZC3H12A：又称 “Regnase-1”，是一种 RNA 内切酶，可降解促炎细胞因子（如 IL-6）的 mRNA，敲除后 CAR-T 细胞内 IL-6 等细胞因子的稳定性提升，减少凋亡；RC3H1：编码 “AUF1” 蛋白，参与 mRNA 的降解与稳定性调控，敲除后可维持 CAR-T 细胞中 “抗凋亡基因”（如 Bcl-2）的 mRNA 水平，提升早期存活。然而，这些基因的敲除仅能延缓 CAR-T 细胞的衰退，无法阻止其在晚期（28 天）的数量下降 —— 说明它们并非调控持久性的 “核心因子”。
（三）体内晚期筛选：CDKN1B 是 CAR-T 持久性的 “关键刹车”在荷瘤小鼠体内晚期（注射后 21-28 天），敲除CDKN1B的 CAR-T 细胞展现出 “颠覆性” 的持久性优势，这也是本研究最核心的发现：
通过流式细胞术追踪发现：
对照组 CAR-T 细胞在注射后 21 天几乎检测不到（骨髓中比例 敲除 CDKN1B 的 CAR-T 细胞在 28 天时，骨髓中比例仍高达 5%-8%，外周血中比例达 2%-3%，存活时间较对照组延长至少 2 倍。增殖活性：EdU 掺入实验显示，28 天时敲除 CDKN1B 的 CAR-T 细胞仍有 15%-20% 处于 S 期（DNA 合成期），而对照组几乎为 0；功能指标：IFN-γ 与 TNF-α 的分泌量在 28 天时仍为对照组的 5-6 倍，对 MM 细胞的杀伤效率维持在 70% 以上（对照组 表型优化：敲除 CDKN1B 的 CAR-T 细胞中，“记忆性 T 细胞表型”（CD45RO+CD62L+）的比例达 40%-50%（对照组 60%）—— 记忆性 T 细胞是 CAR-T 长期存活的关键，其比例升高直接意味着持久性提升。肿瘤负荷：注射后 28 天，敲除 CDKN1B 的 CAR-T 治疗组小鼠，骨髓中 MM 细胞比例仅为 5%-10%（对照组 > 80%），且无明显骨损伤（Micro-CT 显示骨密度正常）；生存率：对照组小鼠的中位生存期为 25 天，而敲除 CDKN1B 的 CAR-T 治疗组，中位生存期未达到（观察 60 天时仍有 60% 的小鼠存活），生存率提升至少 2 倍。四、机制解析：CDKN1B/p27^Kip1 如何 “刹车” CAR-T 持久性？CDKN1B 基因编码的p27^Kip1 蛋白是细胞周期调控领域的 “明星分子”，其核心功能是抑制细胞周期从 G1 期向 S 期过渡 —— 当 p27 与 cyclin E-CDK2 复合物结合时，会阻断 CDK2 的激酶活性，导致细胞停滞在 G1 期，无法进入 S 期进行 DNA 合成，最终引发增殖停滞或衰老。
研究团队通过一系列机制实验证实，p27 在 CAR-T 细胞中通过以下两种方式限制持久性：
在正常 CAR-T 细胞中，随着体内存活时间延长，p27 的蛋白水平会逐渐升高（28 天时较 7 天升高 8-10 倍）：
升高的 p27 与 cyclin E-CDK2 结合，使 CDK2 磷酸化水平下降 60%-70%，导致细胞周期停滞在 G1 期；长期停滞的 CAR-T 细胞会逐渐进入 “衰老状态”（表现为 p16^INK4a 蛋白升高、端粒缩短），最终被机体清除。而敲除 CDKN1B 后，p27 蛋白完全缺失，cyclin E-CDK2 持续激活（磷酸化水平维持在高水平），CAR-T 细胞可不断从 G1 期进入 S 期，实现 “长期增殖而不衰老”。
p27 不仅调控细胞周期，还可通过影响 “T 细胞耗竭通路” 削弱 CAR-T 功能：
研究发现，p27 可与 NFATc1（T 细胞活化关键转录因子）结合，抑制 NFATc1 向细胞核转移，进而减少 “抗耗竭基因”（如 T-bet、Eomes）的表达；敲除 CDKN1B 后，NFATc1 核转位效率提升 3-4 倍，T-bet、Eomes 的表达量升高 2-3 倍，有效抑制 PD-1、LAG-3 等耗竭标志物的表达，维持 CAR-T 细胞的效应功能。该研究的最大价值在于 —— 找到一个 “可直接编辑” 的内在基因靶点（CDKN1B），为解决 CAR-T 持久性难题提供了 “精准可行” 的临床转化方向。
目前临床使用的 CAR-T 细胞多为 “未经基因编辑的自体细胞”，持久性不足是其核心缺陷。若通过 CRISPR-Cas9 技术在 CAR-T 细胞制备过程中敲除 CDKN1B，有望实现：
延长体内存活时间：从目前的 1-2 个月延长至 6 个月以上，甚至更久；降低复发率：长期存活的 CAR-T 细胞可实时清除残留肿瘤细胞，将 MM 的复发率从 50%-60% 降至 20% 以下；适用人群扩展：对于 “CAR-T 疗效不佳” 的患者（如体内 CAR-T 增殖能力弱、易耗竭），CDKN1B 敲除型 CAR-T 可能成为新的治疗选择。CDKN1B 并非全新基因，其功能与调控机制已研究数十年，且已有研究证实：
正常 T 细胞中 CDKN1B 敲除不会导致 “过度增殖” 或 “恶性转化”（因体内存在其他细胞周期调控因子如 p21）；动物实验中，敲除 CDKN1B 的 CAR-T 细胞未引发明显毒性（如细胞因子释放综合征 CRS、神经毒性 ICANS），小鼠体重、肝肾功能均正常。这意味着 CDKN1B 敲除型 CAR-T 的临床转化风险较低，可快速进入 I/II 期临床试验（预计 3-5 年内可开展）。
除单独敲除外，CDKN1B 还可与其他靶点联合编辑，实现 “1+1>2” 的效果：
联合 RASA2/SOCS1 敲除：CDKN1B 负责 “长期持久性”，RASA2/SOCS1 负责 “早期增殖”，联合编辑可同时提升 CAR-T 的早期扩增与晚期存活；联合 PD-1 敲除：PD-1 是外在耗竭信号，CDKN1B 是内在耗竭调控因子，联合编辑可从 “内外双途径” 抑制 CAR-T 耗竭，进一步增强疗效。尽管 CDKN1B 的发现为 CAR-T 优化带来希望，但要实现临床转化，仍需解决以下问题：
该研究仅在 BCMA-CAR-T（针对 MM）中验证了 CDKN1B 的作用，需进一步确认其在其他靶点 CAR-T 中的效果，如：
CD19-CAR-T（针对白血病、淋巴瘤）；CD22-CAR-T（针对复发难治性白血病）；GPC3-CAR-T（针对肝癌）等。若 CDKN1B 在多种 CAR-T 中均能提升持久性，则其临床价值将大幅提升。
目前 CRISPR-Cas9 在原代 T 细胞中的编辑效率约为 50%-70%，仍需优化：
提升编辑效率：通过优化 sgRNA 设计、改进转染方法（如电穿孔、病毒载体），将效率提升至 90% 以上；降低脱靶效应：使用 “高保真 Cas9”（如 Cas9-HF1）或 “碱基编辑技术”（不切割 DNA 双链，仅修改碱基），减少脱靶突变风险。对于不适合基因编辑的患者（如儿童、肝肾功能不全者），可开发 “p27 抑制剂”：
小分子抑制剂：筛选可特异性抑制 p27 与 cyclin E-CDK2 结合的小分子药物，在 CAR-T 治疗后口服给药，提升体内 CAR-T 的持久性；抗体药物：开发靶向 p27 的单克隆抗体，通过阻断 p27 的功能，间接提升 CAR-T 细胞的存活与增殖。这篇《Nature》研究以 “CAR-T 持久性不足” 这一临床痛点为切入点，通过 “体内 CRISPR 筛选” 这一革新性技术，首次揭示了 CDKN1B 是限制 CAR-T 细胞长期存活的核心因子 —— 其编码的 p27^Kip1 蛋白通过 “抑制细胞周期 + 促进功能耗竭” 双重机制，成为 CAR-T 持久性的 “关键刹车”。
该研究的突破不仅在于 “找到一个靶点”，更在于建立了 “体内基因筛选→机制解析→临床转化” 的完整研究范式，为后续 CAR-T 疗法的优化提供了 “可复制” 的研究思路。未来，随着 CDKN1B 敲除型 CAR-T 进入临床试验，多发性骨髓瘤乃至其他血液瘤、实体瘤的 CAR-T 治疗，有望从 “短期缓解” 迈向 “长期治愈” 的新阶段。
来源：医学顾事