摘要：骨髓（BM）内的多种细胞类型，包括免疫系统细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞，都可能参与多发性骨髓瘤（MM）的发展。MM患者通常存在免疫功能低下，这很可能与体内形成的抑制性微环境有关。
骨髓（BM）内的多种细胞类型，包括免疫系统细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞，都可能参与多发性骨髓瘤（MM）的发展。MM患者通常存在免疫功能低下，这很可能与体内形成的抑制性微环境有关。
多发性骨髓瘤细胞本身可以影响宿主的免疫系统。这些细胞促使树突状细胞向有利于生成具有调节作用而非攻击性T细胞的成熟状态转变。与正常浆细胞不同，原发性多发性骨髓瘤（MM）细胞会表达CD1d抗原，并能激活不变自然杀伤T细胞。
许多常用化疗药物在亚细胞毒性浓度下使用时，会显著增强树突状细胞（DC）的刺激能力。研究显示，姜黄素衍生物FLLL32能选择性抑制STAT3磷酸化和STAT3 DNA结合，通过降低多发性骨髓瘤及其他具有持续活化STAT3信号通路的癌细胞活力，进而诱导其凋亡。
最近，在多发性骨髓瘤细胞系U266中观察到大和米蕈（MGN-3/Biobran）和姜黄素协同诱导细胞凋亡的潜力。
既往大和米蕈（MGN-3/Biobran）的研究提示，该制剂可能具有免疫调节特性，主要是通过作用于NK细胞并增强其活性。研究人员已经证明大和米蕈（MGN-3/Biobran）诱导了体外人单核细胞源性树突状细胞。
在这项随机安慰剂对照研究中，科研团队评估了大和米蕈（MGN-3/Biobran）对MM患者先天免疫系统参数的潜在调节作用。
材料和方法
1、患者
在多发性骨髓瘤（MM）诊断过程中，通过骨髓穿刺评估浆细胞比例，并采用形态学检查和血清电泳检测单克隆免疫球蛋白（Ig）的存在。术前评估包括全血细胞计数、肝肾功能生化指标检测以及β2-微球蛋白和C反应蛋白分析。通过影像学骨骼检查评估骨病变情况。
在一项随机双盲安慰剂对照研究中，共有48例确诊MM患者（其中27例，即56 %为IgG亚型）接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）辅助支持前后评估（招募患者中三分之一接受安慰剂），其基线特征汇总于表1。
表1安慰剂组和MGN-3组患者的基线特征
接受治疗的患者根据化疗方案交替使用烷化剂（美法仑、环磷酰胺）、蒽环类药物（多柔比星、伊达比星）和糖皮质激素（地塞米松）。对于单克隆Ig阳性、骨髓穿刺显示浆细胞比例低于20 %且不符合CRAB标准的患者，不进行化疗而仅接受观察。患者每日服用2克大和米蕈（MGN-3/Biobran）颗粒粉或等量溶于水的安慰剂。
2、大和米蕈（MGN-3/Biobran）
大和米蕈（MGN-3/Biobran）是一种从米糠半纤维素中提取的营养补充剂，经由灵芝菌丝体（香菇）的多种水解酶进行酶处理。其活性成分是阿拉伯木聚糖，其主链含有木糖，侧链含有阿拉伯糖聚合物，由日本东京大和制药株式会社提供。
3、基于流式细胞术的细胞毒性检测
效应细胞外周血单核细胞（PBMC）通过Pancol 密度梯度离心法从肝素处理的试管中收集的样本中分离。从界面收集的单核细胞经PBS洗涤两次后，重悬于10毫升完全培养基(CM；RPMI 1640培养基，含10 %热灭活胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素及2 mM L-谷氨酰胺）中，随后用于细胞毒性检测。
4、细胞免疫表型分析
研究人员采用以下小鼠抗人单克隆抗体（mAbs）分析多发性骨髓瘤（MM）患者外周血中的髓系树突状细胞（mDCs）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）及自然杀伤细胞亚群：CD11cFITC、CD16-FITC、CD123-PE、CD56-PE、HLA-DR-ECD、CD45-ECD、CD3-PC5、CD14-PC5、CD16-PC5和CD19-PC5。
通过以下特征共同缺失可判定循环中mDC和pDC亚群：谱系标志物（CD3 -、CD14 -、CD16 -和CD19 -）缺失、HLA-DR表达缺失且互斥。分别检测CD11c和CD123在膜上的表达情况。
5、多微珠细胞因子免疫分析法
血浆样本由肝素化的外周血（1毫升）经5,000转/分钟离心10分钟制备。收集上清液，通过无菌0.22微米孔径滤膜过滤后，分装保存于在分析前将样本置于-80℃冷冻保存。
使用Bio-Plex悬浮阵列系统检测血浆中细胞因子水平，包括IL-1β、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12（p70）、IL-13、IL-15、IL-17、IFN-κ及肿瘤坏死因子（TNF）-a。
结果
1、大和米蕈（MGN-3/Biobran）增强MM患者NK细胞溶解活性
在CD45+ CD3 -外周淋巴细胞中，大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗组与安慰剂组患者的溶细胞型CD56 双阳性 CD16+，NK细胞及分泌细胞因子的CD56、CD16NK细胞基线百分比无显著差异（分别为24.5±2.8%vs.17.5±3.5%，p = 0.128；以及1.4 ± 0.2 % vs. 2.2 ± 1.0 %，p=0.683）。治疗期间NK细胞的CD56 双阴性与CD56 高亮亚群百分比未出现统计学显著变化（数据未显示）。
科研人员采用基于流式细胞术的细胞毒性分析法，检测了接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗的多发性骨髓瘤患者（N = 32）与安慰剂对照组（N = 16）外周血单个核细胞（PBMCs）中自然杀伤（NK）细胞对易感K-562靶细胞的杀伤活性。
血液样本分别在治疗前一周（基线值）、治疗1、2及3个月时采集。NK细胞杀伤活性通过两种方式评估：当效应细胞与靶细胞比值为50：1、25：1和12.5：1时的光释光（PSL）强度（图1 a)，以及通过计算每10个7效应细胞产生20 %细胞毒性所需的发光单位（LU）数量（图1 b)。
在PSL的E/T比值分别为50：1、25：1和12.5：1时，大和米蕈（MGN-3/Biobran）组与安慰剂组的NK活性基线水平未呈现统计学显著差异（p值分别为0.297、0.257和0.307），以LUs为单位的比较也未发现显著差异（p = 0.814）。
NK细胞溶解活性较基线水平显著提升：在50：1比值时达到27±4.1%；在25：1比值时为17.1 ± 3.1 %；9.7 ± 1.9 %在大和米蕈（MGN-3/Biobran）组中，所有三个E/Tratios在1个月后(39.8 ± 5.8 %，p＜0.001在50：1；25 ± 3.6 %在25：1时，p = 0.003；13.9 ± 2.2 %在12.5：1时，p = 0.008)和2个月的治疗(39.3 ± 5.7 %，p = 0.038在50：1时；25.3 ± 4.1 %在25：1时，p = 0.021；14.4 ± 2.6 %的治疗组（12.5：1剂量比，p = 0.044；图1 a)。
通过溶菌单位对比也证实了NK细胞活性的提升：大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗1个月后（47.0±7.4LU，p = 0.045)和2个月后（56.6 ± 12.2 LU，p = 0.029；图1 b）的NK细胞活性较基线水平（30.8 ± 7.4 LU）显著增加。而在治疗期间，安慰剂组的NK活性未观察到显著变化（图1 a、b）。
图1：大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗对多发性骨髓瘤患者NK细胞溶解活性的影响。通过基于流式细胞术的CAM毒性检测法，分别在治疗前（基线）、治疗后1、2或3个月时，评估了接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗（N = 32）和安慰剂治疗（N = 16）的多发性骨髓瘤患者外周血单个核细胞中NK细胞对靶细胞K-562的溶解活性。
统计学显著性：
*p
2、大和米蕈（MGN-3/Biobran）增加循环髓样DC水平
在使用前（基线）和使用后1、2、3个月，在大和米蕈（MGN-3/Biobran）组（N = 20）和安慰剂组（N = 15）患者中检测了CD11c-、CD123+髓系树突状细胞和CD11c-、CD123+浆细胞样树突状细胞的频率以及mDC/ pDC比值（图2 )。安慰剂组和MGN-3治疗组中mDC的百分比无统计学显著性差异。
基线检测时（p = 0.103）。与基线水平相比，接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）3个月后，HLA-DR阳性-外周白细胞中循环mDCs的比例显著升高（25.8 ± 3.6 % vs. 17.6 ± 2.6 %，p = 0.036），而安慰剂组随时间推移未见明显变化。
大和米蕈（MGN-3/Biobran）组与安慰剂组的循环pDCs基线值相近（16.6±2.4%vs.24.9±5.6%），治疗期间未见显著变化（图2 a)。mDC/pDC比值（图2 b)在MGN-3治疗3个月后随时间推移显著增加（p = 0.030），而安慰剂组的mDC/pDC比值未随时间出现明显变化。
图2 ：大和米蕈（MGN-3/Biobran）使用后循环树突状细胞亚群的变化。通过流式细胞术分析了接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）（N = 20）和安慰剂（N = 15）的多发性骨髓瘤患者外周血中CD11c、CD123 - mDC和CD11c 、CD123 、pDC的水平，分别在使用前（基线值）及使用1、2、3个月后进行检测。*p
3、MM患者Th1/Th2特征的表征
晚期癌症患者常出现细胞介导免疫功能受损，这与局部肿瘤微环境及外周血中Th1型向Th2型细胞因子模式的转换密切相关。在分析的Th1型细胞因子中，仅干扰素-γ（IFN-γ）在多发性骨髓瘤患者（N = 45）中显著高于健康对照组（N = 30；见表2）。
相比之下，在分析的七种Th2型细胞因子中，科研人员发现有六种存在显著差异：白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-13（IL-13）的血浆浓度在患者中明显高于健康对照组（中位数、四分位距（IQR）及p值详见表2 )。
然而，白细胞介素-9（IL-9）和白细胞介素-10（IL-10）的浓度在患者中则显著低于健康对照组（中位数、IQR及p值见表2 )。
表2 ：MM患者与健康供体之间Th1和Th2细胞因子水平的比较
通过基于微珠的多重免疫分析法评估了多发性骨髓瘤患者（N = 45）和健康供体（N = 30）中Th1和Th2细胞因子的血浆浓度（pg/ml）。结果以中位数及四分位距(IQR；25-75百分位）表示。采用曼-惠特尼秩和检验计算p值（* p
科研人员还分析了多发性骨髓瘤患者与健康供体中5种Th1细胞因子（干扰素-γ、白细胞介素-1b、IL-2、IL-12和IL-15)以及6种Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13）的Th1/Th2比值（图3 )。
在健康人群中，30个分析的Th1/Th2比值中有20个大于1.0，仅有10个小于1.0（Th1/Th2比值为20：10）。而在多发性骨髓瘤患者中，14个Th1/Th2比值大于1.0，另有16个＜1.0 (Th1/Th2评分14：16），这表明在MM患者中，Th2免疫可能主要处于活跃状态。
具体而言，与健康供体相比，观察到MM患者的IL-12/IL-6、IL-12/IL-13、IL-2/IL-6、IL-2/ IL-13、IL-15/IL-4、IL-15/IL-5和IL-15/IL-13比值向Th2模式转变。
图3：展示了健康供体（HD）与多发性骨髓瘤（MM）患者体内Th1/Th2细胞因子比值。图中呈现了5种Th1细胞因子（行：IFN-κ、IL-1b、IL-2、IL-12和IL-15)与6种Th2细胞因子（列：IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13)的比值（共计30个Th1/Th2比值）。
4、大和米蕈（MGN-3/Biobran）对Th1和Th2细胞因子水平的影响
科研人员还评估了接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）（N = 30）或安慰剂（N = 15；图4 4）患者的Th1和Th2细胞因子血浆浓度。在比较两组的基线值时，未观察到统计学显著差异。
经过1个月大和米蕈（MGN-3/Biobran）使用后，与使用前基线水平相比，IL-1b（p = 0.047）、IL-12（p = 0.011）、IL-17（p = 0.036）和TNF-a（p = 0.01）水平显著升高（图4 a）。
3个月后，大和米蕈（MGN-3/Biobran）组中IL-12（p≤0.001）、IL-17（p = 0.032）、IFN-c（p = 0.018）和TNF-a（p = 0.007）水平均有所上升（图4 a)。
在Th2细胞因子中，大和米蕈（MGN-3/Biobran）组的IL-5和IL-9水平显著升高（分别为p=0.014和p=0.031）。然而，安慰剂组在治疗1个月后IL-10水平显著降低（p = 0.037），而大和米蕈（MGN-3/Biobran）组和安慰剂组的IL-4水平均升高。
基线水平（分别为p=0.034和p=0.024）。大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗3个月后，IL-4（p = 0.003）、IL-6（p = 0.031）、IL-9（p = 0.006）、IL-10（p = 0.010）和IL-13（p = 0.002）水平较安慰剂组显著升高，而大和米蕈（MGN-3/Biobran）组和安慰剂组的IL-5水平均升高（分别为p=0.006和p = 0.004；图4 b)。
图4 ：大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗后Th1和Th2细胞因子谱的变化。采用基于微珠的多重免疫测定法，测定了接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）（N = 30）或安慰剂（N = 15）患者血浆中Th1细胞因子、IL-17及b Th2细胞因子的浓度（pg/ml）。统计学显著性：*p
讨论
最新研究表明，自然杀伤（NK）细胞通过发挥抗骨髓瘤细胞毒性在骨髓瘤免疫监视中发挥重要作用。随着疾病进展，骨髓瘤细胞表面NK细胞受体及其配体的差异性表达反映了免疫编辑过程——这种机制筛选出对NK细胞介导的裂解具有抗性的更具侵袭性的克隆。
新型管理办法可增强抗骨髓瘤细胞毒性效果，例如通过过继转移技术移植经体外激活、抗骨髓瘤活性增强的NK细胞，或采用蛋白酶体抑制剂与免疫调节药物的联合管理方案，这些方法已被证实能有效提升NK细胞的数量和功能。
科研人员评估了MM患者接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗期间外周血中NK细胞活性。与既往发表的数据一致，他们观察到NK介导的细胞毒性显著增加。在大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗的前两个月内，虽然在安慰剂对照组中未检测到NK细胞毒性的统计学显著性差异，但是，在MM患者中进行的表型分析未显示NK细胞亚群的百分比发生变化。这一效应类似于在人类中观察到的使用其他类型天然产物治疗时的结果。
结论
研究结果显示，与安慰剂组相比，接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）辅助管理的多发性骨髓瘤患者外周血中自然杀伤细胞活性显著增强、髓源性树突状细胞数量增加，且血浆中Th1相关细胞因子水平明显升高。为阐明其作用机制，需进一步开展免疫调节作用研究，重点聚焦骨髓微环境这一关键领域。
免责声明：大和米蕈LENTIN Plus 1000LY作为一款免疫调节剂，属于保健食品，不能代替药物治疗疾病，大家应理性对待。
来源：健康归我管
