摘要：淀粉和糖原是自然界中最主要的碳水化合物储存形式，它们不仅是人类饮食中的能量基础，也是食品和健康产业的重要原料。通过生物催化，这些线性多糖能够被转化为结构独特的环状分子——大环多糖（cycloamyloses，CAs）。与常见的小分子环糊精相比，大环多糖具有更高
淀粉和糖原是自然界中最主要的碳水化合物储存形式，它们不仅是人类饮食中的能量基础，也是食品和健康产业的重要原料。通过生物催化，这些线性多糖能够被转化为结构独特的环状分子——大环多糖（cycloamyloses，CAs）。与常见的小分子环糊精相比，大环多糖具有更高的溶解性和更好的生物安全性，在膳食纤维补充、肠道健康维护以及药物递送等方面展现出广阔的应用前景。然而，大环多糖的工业合成长期受限于关键催化酶——淀粉麦芽糖转移酶（amylomaltase，AM）的复杂机理，其既能催化链段环化，又存在水解副反应，导致产率通常停留在 50–60% 之间。
近日，中国科学院天津工业生物技术研究所宗志友等人在 Journal of the American Chemical Society发表题为“Cyclization Decoded: Engineering Amylomaltase for Efficient α-Glucan Transformations”的研究。该研究首次在原子层面上完整解析了淀粉麦芽糖转移酶的环化机制，并通过理性酶工程设计，成功获得环化效率提升 2.3 倍的突变体，为大环多糖的规模化生产提供了坚实的分子基础。
图 | 淀粉麦芽糖转移酶催化生成环化产物和水解产物全过程
为了揭示环化如何发生，研究团队利用分子动力学模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）计算，从整体上描绘了 AM 的催化循环。
通常情况下，淀粉是一条条由葡萄糖单元通过 α-1,4 糖苷键首尾相连的长链结构。淀粉麦芽糖转移酶的独特之处在于，它不仅能切断这条长链，还能促使链的非还原端折回，与链的另一部分重新结合，形成一个闭合的大环多糖。这一过程并非单一步骤，而是一个涉及多步分子事件的复杂反应序列。
模拟显示，这一过程可以分为四个阶段：首先是糖基化，即底物与酶形成一个糖基-酶共价中间体；接着是非共价链转移，底物的非还原端在酶表面进行大尺度迁移，逐渐接近催化口袋；随后是预转糖基化状态的形成，当链段正确定位后，为最终的化学键形成做好准备；最后则是转糖基化，新糖苷键生成，一个环状结构由此诞生。
然而，整个过程中存在竞争反应——如果水分子进入催化中心，便会触发水解，导致底物断裂为线性寡糖，这种竞争性是长期制约环化效率的关键原因。
图 | 淀粉麦芽糖转移酶环化和水解自由能图谱
更关键的是，研究团队发现，真正决定环化反应效率的并不是最后一步的共价键形成，而是第二步的链转移，尤其当底物分子较长时，非共价链转移将成为反应过程的关键瓶颈。计算结果表明，当底物聚合度超过 30 时，链转移的能量屏障可达 13.6 kcal/mol，甚至超过了转糖基化的 12.8 kcal/mol，直接限制了整体的环化效率，这一结论打破了此前普遍认为化学键断裂与形成是限速步骤的认知。
在环化机理明确之后，研究团队据此开展了有针对性的酶工程改造。他们通过结构分析与计算筛选，锁定了一些在链转移过程中对底物形成过度约束的氨基酸残基，并通过定点突变削弱这些相互作用。
实验中最具代表性的改造位点是 D56。在野生型酶中，D56 与底物会形成稳固的氢键，相当于把链条固定在酶表面。将其突变为丙氨酸（D56A）后，氢键消失，链端迁移的空间自由度增加，结果环化效率提高了 2.3 倍。另一关键残基 H294 位于催化口袋，其空间位置决定了底物非还原端能否与受体碳原子充分接近。将其突变为半胱氨酸（H294C）后，底物关键原子间距缩短约 5%，使转糖基化更为顺利，环化效率因此提升了约 1.3 倍。
这些结果不仅停留在计算层面，还通过质谱与产物分析得到了实验证实。研究人员采用高分辨质谱（UPLC-TripleTOF-MS）检测产物，证实改造后的酶能够稳定合成出聚合度在 22 至 61 之间的大环多糖，其分布与理论预测高度吻合。这说明针对非共价链转移步骤的分子改造，确实能够显著提升环化产率。
总之，这项研究不仅揭示了 AM 酶催化的原子机制，还提供了一套基于机制的酶工程策略，为高效合成环状 α-葡聚糖奠定了理论基础，这意味着未来有望以更低的成本制备不同聚合度的大环多糖，无论是作为新型可溶性膳食纤维，还是作为药物递送的理想载体，大环多糖都将迎来更加广阔的应用前景。
参考文献：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40878876/#full-view-affiliation-2
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来源：生辉SciPhi