南开大学史林启/中国医科院黄帆JACS：天然分子伴侣Spy模拟物：定制具有静电-疏水协同机制的纳米分子伴侣用以增强蛋白质折叠调控

摘要：蛋白质折叠的调控对于维持蛋白质正确结构和正常生物学功能具有重要意义。然而，蛋白质折叠在本质上是容易出错的，而且该过程是由多种动态相互作用（如疏水、静电、氢键和范德华力等）之间的平衡决定的，这使得蛋白质更容易发生错误折叠和聚集，从而导致其功能障碍。而且，蛋白质通

蛋白质折叠的调控对于维持蛋白质正确结构和正常生物学功能具有重要意义。然而，蛋白质折叠在本质上是容易出错的，而且该过程是由多种动态相互作用（如疏水、静电、氢键和范德华力等）之间的平衡决定的，这使得蛋白质更容易发生错误折叠和聚集，从而导致其功能障碍。而且，蛋白质通常不是静态的，它们的结构会随着外界环境的改变而动态变化，这进一步增加了蛋白质正确折叠的难度。目前，研究人员已开发了出许多基于不同材料的蛋白质折叠调控策略，包括小分子添加剂、聚合物、水凝胶、多孔材料和各种纳米颗粒等。尽管取得了巨大的进步，但是这些方法中大多数只适用于有限范围的蛋白质，而且很少有方法能够适应蛋白质的动态特性，从而严重限制了它们调控蛋白折叠的效率。因此，开发一种高效通用的蛋白折叠调控平台仍然是一项重大的挑战。

在生物体内，蛋白质的正确折叠过程是由一类被称作分子伴侣的特殊蛋白质协助完成，其中分子伴侣Spy因其独特的结构和工作机制成为了研究分子伴侣-客体蛋白相互作用的典范模型。近日，南开大学史林启教授与中国医学科学院放射医学研究所黄帆研究员团队通过合理设计具有可定制表面和特性的纳米分子伴侣 (nChap)，发展了一种模拟天然伴侣Spy结构和静电-疏水动态协同机制的蛋白质折叠调控策略。在该策略中，nChap可首先利用表面可调的带电基团，模仿Spy通过远程静电吸引作用快速捕获不同的客体蛋白，随后通过近程疏水相互作用将捕获的蛋白动态结合到其表面模拟Spy的疏水空腔中。基于此，客体蛋白被隔离并稳定在nChap表面模拟分子伴侣的受限空间中，这样不仅可以有效阻止蛋白质之间的不可逆聚集，还可以为促进蛋白质折叠创造一个合适的环境，从而实现对蛋白质折叠的动态调控。更重要的是，得益于表面可调控的电荷、多重的疏水空腔和出色的结构稳定性，这种仿生nChap不仅适用于9种不同等电点和分子量的客体蛋白，而且在高温等外部压力和长期储存条件下仍能保持伴侣活性，这是天然 Spy 难以实现的。因此，这种 Spy 模拟物为开发高效的蛋白质折叠调控策略提供了新范式（图1 ）。

图1.基于静电-疏水协同机制的定制纳米分子伴侣模拟天然分子伴侣Spy调控蛋白质折叠的示意图。

研究团队利用两亲性嵌段共聚物自组装制备了一系列具有可调带电表面和疏水微域nChap，通过在PEG末端官能化胍基(Gua)、氨基(NHO)、羧基(COOH)、磺酸基(Sulfo)和磷酸基(Phos) 获得了具有类似Spy电荷表面的nChap。动态光散射与透射电子显微镜表明nChap具有均匀的球形形貌。相转变核磁与静态光散射证实，nChap的刺激响应性PAE链段能够响应环境的变化实现疏水转变，并塌缩在PCL内核上形成疏水微域。Zeta电位分析进一步表明nChap具有可调控的电荷表面。这些特征对于模拟Spy 伴侣机制中的静电-疏水协同相互作用至关重要，有利于nChap高效地执行多种分子伴侣功能（图2 ）。

图2. nChap构建与基本性质的表征

为了评估 nChap调节热变性蛋白质折叠的能力，选择了六种不同等电点(pI) 的蛋白作为模型。在经历热刺激后，与对照组相比，nChap的存在能够显著提高具有相反电性蛋白质的活性。圆二色光谱与内源荧光测试结果表明，nChap能够恢复蛋白质的二级和三级结构。另外，透射电子显微镜实验表明，nChap能够抑制蛋白质在高温状态下形成不可逆的聚集体。值得注意的是，无论是在高温热刺激还是长效储存实验中，NH2-nChap和COOH-nChap分别对相反电性蛋白质展现出最高的伴侣活性，说明nChap与客体蛋白之间静电吸引是nChap高效执行伴侣功能的关键因素之一（图3 ）。

图3. nChap提高蛋白质活性和稳定蛋白质构象的研究

进一步研究了nChap与客体蛋白之间的相互作用力，实验结果表明，适当的静电吸引有助于更多的客体蛋白进入nChap的疏水微域，有利于nChap获得更高的伴侣活性。而过度的静电吸引则会将客体蛋白困于nChap的带电壳层，阻碍了nChap对客体蛋白执行伴侣功能。NH2-nChap和COOH-nChap因其能够提供合适的静电-疏水协同作用力，促进客体蛋白与nChap疏水微域接触，从而分别对负电蛋白和正电蛋白展现出最好的伴侣功能。尤为重要的是，nChap能够在逐渐加剧的热刺激中适应客体蛋白构象的动态变化，提供足够的疏水结合位点以容纳客体蛋白逐渐暴露的疏水残基，这是天然Spy难以做到的（图4 ）。

图4. nChap与客体蛋白之间的静电-疏水协同作用机制的研究

最后，对比天然Spy与nChap的伴侣活性实验表明，nChap具有比Spy更高的抑制变性蛋白聚集和辅助变性蛋白重折叠的能力。当蛋白质受到热变性时，这种差异尤为明显，Spy稳定蛋白质构象和辅助蛋白质重折叠的能力随着温度升高迅速下降，而nChap能够在较宽的温度范围内维持蛋白质构象并保持较高的蛋白质重折叠效率，证明nChap具有比Spy具有更稳健的伴侣功能（图5 ）。

图5.天然Spy与nChap伴侣功能对比的研究

该研究以“Natural Spy Chaperone Mimic: Tailored Nanochaperone with Electrostatic-Hydrophobic Synergy To Enhance Protein Folding Regulation”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。南开大学史林启教授与中国医学科学院放射医学研究所黄帆研究员为本文通讯作者，南开大学博士研究生赵舒月为本文第一作者，上海交通大学全舒教授与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心何为副研究员共同参与研究并提供大力支持。该研究得到了国家自然科学基金，国家重点研发计划，天津市自然科学基金重点项目，中国医学科学院医学与健康科技创新工程等项目的支持。