摘要：丙酮酸是细胞代谢中的关键分子。它是糖酵解的最终产物，也是需氧和厌氧呼吸的初始步骤。在需氧条件下，丙酮酸进入线粒体，在那里它经历进一步的氧化，通过克雷布斯循环和氧化磷酸化产生能量丰富的分子，如ATP。或者，在厌氧条件下，丙酮酸可以转化为乳酸，再生糖酵解继续所需的

丙酮酸是细胞代谢中的关键分子。它是糖酵解的最终产物，也是需氧和厌氧呼吸的初始步骤。在需氧条件下，丙酮酸进入线粒体，在那里它经历进一步的氧化，通过克雷布斯循环和氧化磷酸化产生能量丰富的分子，如ATP。或者，在厌氧条件下，丙酮酸可以转化为乳酸，再生糖酵解继续所需的辅因子NAD+。丙酮酸还作为各种生物合成途径的关键前体，包括氨基酸和脂肪酸的合成。它在能量生产和生物合成中的核心作用使丙酮酸成为细胞过程中的基本分子。AkrivisBio丙酮酸检测是一种简单敏感的方法，用于定量从低于1μM到10mM范围内的丙酮酸，适用于各种生物样本类型。

艾美捷丙酮酸测定试剂盒：

货号：MA-0129

孔数：100孔

样本类型：组织提取物、细胞裂解物、血清、血浆、尿液、其他生物液体

物种：所有物种

检测方法：比色法，OD 570纳米或荧光法，激发/发射 = 535/580纳米

检测类型：定量

应用：一种基于板的比色法/荧光法检测，用于在1 μM - 10 mM范围内定量各种生物样本中的丙酮酸。

灵敏度：1 uM-10 mM

运输温度：使用冰袋

丙酮酸测定试剂盒组分：

-检测缓冲液25毫升WMMA-0129-A

-ADHP溶液200微升红色MA-0129-B

-丙酮酸氧化酶/过氧化氢酶冻干绿色MA-0129-C

-丙酮酸标准品100微升黄色MA-0129-D

储存和处理：将所有组件储存在-20°C。使用前将其升至室温。打开前短暂离心小瓶。

-检测缓冲液：使用前升至室温。储存在4°C。

-ADHP溶液：升至室温以融化DMSO溶液。混合均匀，储存在-20°C。

-丙酮酸氧化酶/过氧化氢酶：加入220微升检测缓冲液溶解。储存在-20°C。

检测方案：

1.标准曲线：

a.基于吸光度的检测（样本中约100μM–10mM）：通过将10微升标准品转移到990微升检测缓冲液中，将丙酮酸标准品稀释至0.4mM。

b.基于荧光的检测（约0.2μM–100μM）：通过向990微升检测缓冲液中添加10微升标准品，然后将10微升转移到90微升检测缓冲液中，进一步稀释丙酮酸标准品至最终浓度0.04mM。

c.混合均匀。将0–5–10–15–20–25微升加入96孔板中的一系列孔中。通过添加检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升，为比色法检测提供0,2,4,6,8,10纳摩尔/孔的丙酮酸标准品。（荧光法检测为0,200,400,600,800,1000皮摩尔/孔）。

2.样本准备：用50微升检测缓冲液匀浆组织（10毫克）或细胞（10^6）。以16,000Xg离心5分钟，然后将5-50微升清澈上清液加入96孔板中的孔中。将唾液以16,000Xg离心5分钟，然后加入10微升到孔中。可以直接向样本孔中加入血清（10微升）。用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

注意：

a.血清中的LDH活性可以将丙酮酸转化为乳酸。血清样本应储存在-80°C。解冻后立即使用。

b.使用10kDa旋转柱对样本进行去蛋白处理，以去除可能消耗丙酮酸的酶。

c.一些样本背景较高。因此，以双份运行样本，并使用配对孔确定背景。

d.在极少数情况下，内源性化合物可能干扰酶反应。使用配对样本，向其中一个测试样本中添加内标（吸光度2-5纳摩尔，荧光100皮摩尔），以准确测量丙酮酸（下面解释的程序）。

3.启动反应：为要运行的总孔数准备足够的反应混合物。每个孔需要50微升含有以下成分的反应混合物：

1）反应混合物：

样本/标准孔混合

背景对照混合

检测缓冲液46微升（使用荧光时47.6微升）

ADHP溶液2微升（使用荧光时0.4微升）

丙酮酸氧化酶/过氧化氢酶2微升

2）向每个含有丙酮酸标准品和测试样本的孔中加入50微升反应混合物。向背景孔中加入50微升背景对照混合。

4.测量：使用微孔板读取器在室温下通过吸光度（570纳米）或荧光（激发/发射=535/590纳米）监测反应30分钟。

5.典型结果：

6.计算：从所有标准读数中减去0标准读数。绘制丙酮酸标准曲线并确定标准曲线的斜率。该值将用于计算未知测试样本中的丙酮酸。如果运行了背景对照孔，则从每个配对未知样本中减去背景读数。将背景校正后的样本信号除以标准曲线的斜率。这给出了孔中的纳摩尔或皮摩尔丙酮酸。

对于添加了内标的样本，从未知样本中减去添加了已知量丙酮酸的未知样本。获得的信号是系统对添加量的响应。仅含有未知物的孔中丙酮酸的校正量={未知样本信号/[（添加样本信号-未知样本信号）/添加量]}

要将孔中的量转换为原始样本中的丙酮酸量：

A.孔中的丙酮酸纳摩尔数/加入孔中的样本微升数=每微升样本的丙酮酸纳摩尔数。

B.每微升样本的丙酮酸纳摩尔数X样本总体积（原始样本+稀释液体积）=样本中的总丙酮酸纳摩尔数

C.样本中的总丙酮酸纳摩尔数/组织毫克数（或细胞数或血清微升数等）=每毫克组织（细胞等）的丙酮酸纳摩尔数。

来源：科学小怡