《中国大百科全书（第2版）》读书笔记15987-光学显微镜

摘要：早在公元前1世纪，人们就已发现通过球形透明物体观察微小物体时可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。

光学显微镜 optical microscope

利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以提取微细结构信息的光学仪器。

1. 简史

早在公元前1世纪，人们就已发现通过球形透明物体观察微小物体时可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。

1590年荷兰的眼镜制造者造出了类似显微镜的放大仪器。

1610年前后，意大利的伽利略和德国的J.开普勒在研究望远镜的同时，通过改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。

17世纪中叶，英国的R.胡克和荷兰的A.van 列文虎克对显微镜的发展作出卓越的贡献。

1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构和照明系统，并增加了承载标本片的工作台，制成比较完善的显微镜。

19世纪，高质量消色差液浸物镜的出现使显微镜观察微细结构的能力大为提高。

19世纪70年代，德国人E.阿贝奠定了显微镜成像的经典理论基础。

此后，显微镜遂因显微术的发展而在结构和功能上得到不断创新，1850年出现了偏光显微术，1893年出现干涉显微术，1935年荷兰物理学家F.泽尔尼克创造了相衬显微术，为此他在1953年获得诺贝尔物理学奖。

经典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的图像。后来在显微镜中加入摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器件（CCD）等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采焦和处理系统。

2. 工作原理

光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成（图1）。被观察物体AB位于物镜的前方。被物镜放大后成一倒立的实像即第一次像。然后此实像再通过目镜作第二次放大，成一虚像，人眼看到的就是虚像。

2.1. 显微镜的总放大倍率

显微镜总放大率=物镜放大倍率×目镜放大倍率。

显微镜放大倍率是指直线尺寸的放大比而不是面积比。在用人眼直接观察的显微镜中，可以在第一像面处放置一块薄型平板玻璃片——分划板，其上刻有某种图案的线条，如十字线、网格、0.1毫米刻尺等，利用这些分划板便可对物体进行瞄准定位或尺寸测量。

2.2. 显微镜放大倍率的极限

显微镜放大倍率的极限即有效放大倍力。仪器的分辨力是指仪器提供被测对像微细结构信息的能力。分辨力越高则提供的信息越细致。显微镜的分辨力σ是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。根据衍射理论，显微物镜的分辨力为：

（1）

式中λ为所用光波的波长，称为数值孔径。当波长λ一定时，分辨力取决于数值孔径的大小。数值孔径越大则能分辨的结构越细，即分辨力越高。数值孔径是显微物镜的一个重要性能指标，通常与放大倍率一起标注在物镜镜筒外壳上，如40×0.65，表示物镜的放大倍率为40倍，数值孔径为0.65。

分辨力和放大倍率是两个不同但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨力不够高时，即使用较高倍率的目镜，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，这种过大的放大倍率称为无效放大倍率；反之如果分辨力已满足要求而放大力不足，则显微镜虽已具备分辨的潜在能力，但因图像太小仍然不能被人眼清晰视见。为了充分发挥显微镜的分辨力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率满足下列条件：

500＜显微镜总放大倍率＜1000（2）

显微镜使用者应由所需分辨的最小尺寸σ按（1）式确定所需的数值孔径，选定物镜，然后按（2）式选定总放大倍率和目镜放大倍率。

提高分辨力的途径是：采用较短的照明光波或采用数值孔径较大的物镜。

3. 组成

光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图2）。

3.1. 机械系统

主要包括镜架、载物台、镜筒（含物镜转换器）及调焦机构。

①镜架。由基座、镜臂和调焦机构组成。基座和镜臂用于支持载物台、镜筒及光学系统，调焦机构则可以使载物台或镜筒作相调和微调的升降运动，以获得被观察物体的清晰图像。

②载物台。用于承放被观察物体的平台，按复杂程度有固定式和机械式两种。机械式载物台的上层可以在水平面内沿X、Y方向作精密移动，把被观察部位移至视场中央。

③镜筒（含物镜转换器）。用于安装物镜和目镜或其他图像接收装置。根据观察方式（单眼或双眼观察）和接收图像（如照相、投影等）的需要有单筒、双简和三筒3种型式。

3.2. 光学系统

由以下部分组成。

①照明系统。最简单的显微镜照明系统仅是一个采集光线的反光镜。较复杂的显微镜照明系统由灯源和聚光镜构成（采用自然光作光源时由反光镜与聚光镜构成），其功能是提供足够且均匀的物面照明。在聚光镜中设有可变孔光阑以调节照明光束口径，控制标本面的照度。在较完善的照明系统中，还装有控制被照明视场大小的可变视场光阑，以保证被照明物面范围与显微镜视场匹配，减小杂散光对象面反差的影啊。

②物镜系统。位于被观察物体附近，物镜或物镜和中间透镜组成的对物体实现第1级放大的光学系统，放大倍率一般为4～100倍。显微镜物镜按像差校正程度分为消色差、半平场消色差、平场消色差、平场半复消色差、复消色差、平场复消色差等规格。普通的显微镜通常只配备消色差或半平场消色差物镜；需要显微摄影的应用平场类物镜：后两种物镜则用于高级显微镜中。

③目镜。位于人眼之前实现第2次放大的镜头、放大倍率一般在5~16倍，最简单常用的是惠更斯目镜，规格较高的显微镜则配用平场目镜或广角（大视场〉目镜。

4. 分类

采用可见光作为光源的光学显微镜，通常按用途分类。

①生物显微镜。用于观察在透射光照明下经过染色或不染色的生物或其他透明物体的切片标本。

②金相显微镜。用于观察在垂直反射光照明（光线通过物镜投射到被观察物镜表面，再被物面反射后通过物镜成像）下的金相组织或其他不透明物体表面的细微结构。

③体视显微镜。使双眼能从不同视角观察物体从而形成三维空间的立体视觉图像。该类产品广泛用于生物、医学领域，并在工业中用于微小零件和集成电路的装配检查等工作。

④偏光显微镜。根据偏光显微术专门设计的供品体、矿物和材料研究用的显微镜。照明方式一般为透射照明，但也有透反射混合照明的。

利用不同的显微术制成的专门显微镜常见的还有：

①荧光生物显微镜。利用紫外或可见光通过激发滤光片照射经过荧光色素染色处理的标本，使标本中某些组织结构发出荧光，这样从标本发出的光线经抑制滤光片滤去激发光波后便可获得由荧光形成的可见图像，从而使在一般照明情况下觉察不到或无法区分的结构细节能被检出。这类显微镜常用在免疫荧光技术等生物学和临床医学检验中。

②相衬显微镜。利用装在物镜内的相位板使光线在通过无色透明物体的不同组织时所产生的微小周相差转化图像中明暗差别，从而使在一般照明条件下无法观察和区别的物体能被观察到，可广泛应用于生物学、纺织品的纤维结构、玻璃塑料内部的不均匀性等检测及细胞、细菌等活体的观察。

③微分干涉显微镜。利用偏振光干涉原理，使从起偏镜出来的线偏振光，通过双折射棱镜分成振动方向互相垂直的两种线偏振光。两种光经过聚光镜射向标本，再通过物镜后于第2组双折射楼镜处相吻合，在检偏镜处发生干涉，把无色透明的标本转换为明暗相间和颜色变化明显的图像，从而增强图像反差的效果，故名微分干涉显微镜。可用于观察在普通照明下看不到的无色透明物体。此类显微术也可采用反射照明，而用于研究金属学和集成电路制造的工艺中。

④图像分析显微镜。利用扫描原理和光度测量法快速准确进行图像自动定量分析和处理的显微镜。配备相应的软件后可以广泛应用于医学、地质学、金相学、化学和材料科学各个领域。

⑤显微分光光度计。由主机显微镜配备单色仪、扫描驱动器、微机显示终端、打印机等组成。可按标本所含的物质或染色剂对光波吸收的特异性对标本进行定量的测量。广泛应用于生物、医学、石油、采矿等科研领域。