摘要：食品安全国家标准食品营养强化剂 (6S)-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐1范围本标准适用于以叶酸为原料,经甲基化,盐化,结品,冻干等工艺制得的食品营养强化剂(6S)-5-甲基四氢叶酸,氮基葡萄糖盐.2 化学名称,分子式,结构式和相对分子质量2.1 化学名称N-
GB 1903.75-2025 英文版/翻译版 食品安全国家标准 食品营养强化剂 （6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐
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食品安全国家标准食品营养强化剂 (6S)-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐
1范围
本标准适用于以叶酸为原料,经甲基化,盐化,结品,冻干等工艺制得的食品营养强化剂(6S)-5-甲基四氢叶酸,氮基葡萄糖盐.
2 化学名称,分子式,结构式和相对分子质量
2.1 化学名称
N-[4-[[[(6S)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-5-甲基-4-氧代-6-蝶啶]甲基]氨基]苯甲酰子L谷氨
酸,氮基葡萄糖盐
2.2 分子式
C. HIN,O1.
2.3 结构式
2.4 相对分子质量
817.80(无水物)按2022年国际相对原子质量)
3 技术要求
3.1 感官要求
感官要求应符合表1的规定，
附录A
检验方法
A.1 安全提示
本标准中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性,操作时需小心谨慎。若溅到皮肤上应立即用水冲洗,严重者应立即治疗。在使用挥发酸时,要在通风中进行。
A.2 一般规定
本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。
试验中所用标准溶液,杂质测定用标准溶液、制剂及其制品,在没有注明其他要求时,均按 GB/T 601.
GB/T 602,GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。
A.3 鉴别试验(红外光谱法)
采用溴化钾压片法,按照 GB/T 32199 进行试验,试样的红外光谱图应与对照品的谱图一致(对照品图谱见图B1)。
A.4(6S)-5-甲基四氢叶酸,氨基葡萄糖盐和(6S)-5-甲基四氢叶酸(以千基计)的测定
A.4.1 方法提要
试样用水溶解后,采用液相色谱分商,紫外检测器或其他等效检测器检测,标准单点法定量。
A.4.2 试剂和材料
A.4.21 水:GBT 6682 规定的一级水。
A.4.2.2 乙腈:色谱纯。
A.4.23 磅酸二氢悍。
A.4.2.4 氢氧化钾。
A.4.2.5 (6S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品:纯度398.0%,CAS号:151533-22-1,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
A.4.26 氢氧化溶液(20 g/100 ml):称取 20g氢氧化,加水溶解,并定容至 100 ml..
A.4.27 磷酸二氢钾溶液(pH 6.5):称取约6.80g磷酸二氢钾,精确至0.0001g,加水 900 ml,溶解,用氢氧化钾溶液(A4.2.6)调节pH至 6.5,加水定容至1000m1,摇匀,过滤并超声后备用。
A.4.2.8 磷酸二氢钾-乙腈溶液(pH 8.0):称取约 4.08g磷酸二氢,精至 0.0001g,加水 600 ml, 溶解,与350 m1.乙腈混合,用氢氧化钾溶液(A.4.2.6)调节pH至8.0,加水定容至1000mL,播匀,过滤并超声后备用。
A.4.3 仪器和设备
A.4.3.1 高效液相色谱仪:配备紫外吸收检测器,或其他等效的检测器。
A.4.3.2电子天平:感量为0.00018.
A.4.3.3酸度计:精度为士0.02pH.
A.4.3.4超声波清洗器。
A.4.4 色谱参考条件
A.4.4.1 色谱柱:C*柱,250 mmX4.6 mm,粒径5um;或其他等效的色谱柱。
年2流速:1.0 ml/min.
检测波长:280m我母其了
桂温:25 ℃.
A.4.45 进样量:10 m1..
A.4.4.6 流动相:流动相 A为磷酸二氢钾溶液(pH 6.5)(A-4.2.7),流动相B为磷酸二氢钾-乙腈溶液(PH 8.0)(A.4.2.8),采用梯度洗脱,梯度洗脱程序如表 A.1所示。
表 A.1 梯度洗脱程序
A.4.5 分析步骤
A.4.5.1 标准溶液的制备
称取 0.0433g的(6S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品[相当于 0.0400g(6S)-5-甲基四氢叶酸],精确至0.0001g,置于 100 mL,容量瓶中,先用少量水溶解,再用水稀释至刻度,摇匀。所溶液在低于 20℃环境下(在超声浴中放入冰块)超声2min,经0.45 m滤膜过滤后立即进样。
A.4.5.2 试样溶液的制备
称取约 0.070g试样,精确至 0.0001g,置于100 ml,容量瓶中,先用少量水溶解,再用水稀释至刻度,摇匀，所得溶液在低于 20℃环境下(在超声浴中放人冰块)超声2 min,经 0.45 μm 滤膜过滤后立即进样。平行配制两份。
注:溶液均需现配现用,不能长时问存放。
A.4.5.3 系统适用性试验
按照如下步骤执行系统适用性试验:使用带冷却功能的自动进样器,设置温度低于8℃:若使用不带冷却功能的进样器,进样前需将溶液在2℃~8℃下储存。进行6次标准溶液进样,计算表 A.2参数。
A.5.2 试剂和材料
A.5.2.1水:GB/T6682规定的一级水。
A.5.2.2乙腈:色谱纯。
A.5.2.3氢氧化钾。
A.5.2.4磷酸二氢钾。
A.5.2.5 D-(+)-氨基葡萄糖盐酸盐标准品:摩尔质量(Memnos·na)为 215.63 g/mol,纯度≥98.0%,CAS号:66-84-2,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
A.5.2.6 50%乙腈溶液:量取 500 ml水和 500 mL乙腈,混匀。
A.5.鰷鷙某鳄ɑ縛瑃笆鍠険僂妯圆氢氧化钾溶液(20 g/100 mL):称取 20g氢氧化钾,加水溶解,并定容至100 mL,摇均备用。A.5.2.8 磷酸盐缓冲溶液(20 mmol/L):称取 2.72g磷酸二氢钾溶于 900 mL 水中,用氢氧化钾溶液(A.5.2.7)调 pH至7.5,加水定容至1000 mL,摇匀,过滤并超声后备用。
A.5.3 仪器和设备
A.5.3.1高效液相色谱仪:配备紫外吸收检测器,或其他等效的检测器，
4.5.3.2电子天平:感量为0.0001g。
A.5.4 色谱参考条件
A.5.4.1色谱柱:NH:柱,250 mmx4.6 mm,粒径5pm;或其他等效的色谱柱,
A.5.4.2流动相:乙腈+20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(75:25,体积比)。
A.5.4.3流速:1.5 ml/min
A.5.4.4检测波长:195 nm。
A.5.4.5 柱温:35 ℃。
A.5.4.6 进样量:10 pL。
A.5.紓茫 枺笑潺酣睨纎络步骤
A.5.5.1 氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液的制备
称取 0.375g氨基葡萄糖盐酸盐标准品,精确至0.0001g,置于100 ml, 容量瓶中,加50 ml. 50%乙腈溶液溶解后,再用 50%乙腈溶液定容至刻度,摇匀,经0.45 pm 滤膜过滤后立即进样，
A.5.5.2 试样溶液的制备
称取 0.350g试样,精确至 0.0001g,置于100 ml,容量瓶中,加50 mL.50%乙腈溶液溶解后,再用50%乙腈溶液定容至刻度,摇匀,经 0.45 pm 滤膜过滤后立即进样。
注:溶液均需现配现用,不能长时问存故。
A.5.5.3 系统适用性试验氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液进样6次,确定峰面积相对标准差(RSD),拖尾因子和理论塔板数。合格标准:RSD≤2.0%,拖尾因子
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的2%。
4.6 非对映异构体[(6S)-5-甲基四氢叶酸]的测定
A.6.1 方法提要
试样用水溶解后,采用液相色谱分离,紫外检测器或其他等效检测器检测,标准单点法定量。
A.6.2 试剂和材料
4.6.2.1水:GB/T 6682 规定的一级水。
A.6.22异丙醇:色谱纯。
A.6.23磷酸二氢钠。
氢氧化钠。A.6.24A.6.25(6R,S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品:纯度≥98.0%,CAS号:26560-38-3,或经国家认证并授子
标准物质证书的标准品。
A.6.26 氢氧化钠溶液(10 g/100 mL):称取 10g氢氧化钠,加水溶解,并定容至100 mL。
A.6.2.7 100 mmol/L,磷酸钠缓冲溶液:精确称取 12.0g磷酸二氢钠溶于 900 mL水中,用氢氧化钠溶液(A.6.2.6)将 pH 准确调至 7.0,加水定容至1000 mL,摇匀,过滤并超声后备用。
A.6.3 仪器和设备
4.6.3.1高效液相色谱仪:配备紫外吸收检测器,或其他等效的检测器。
4.6.3.2电子天平:感量为 0.1 mg。
4.6.3.3pH 计.
A.6.3.4超声波清洗橢器。
A.6.4色谱参考条件
A.6.4.1色谱柱:HSA 手性柱,100 mmX4.0 mm,粒径5km:或其他等效的色谱柱。
A.6.4.2流动相:异丙醇+100 mmol/1磷酸钠缓冲溶液(6:94,体积比)。
A.6.4.3流速:0.7 mL/min,调整流速,使(6S)-5-甲基四氢叶酸保留时间约为 4.0 min。
A.6.4.4检测波长:225 nm。
A.6.4.5柱温:30 ℃。
A.6.4.6进样量:5 μL。
A.6.4.7 时间:20 min,
A.6.5 分析步骤
A.6.5.1 标准溶液的制备
称取约 0.025 g(6R,S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品,精确至 0.0001g,置于 100 mL 容量瓶中,用90 mL,水溶解,20 ℃ 超声1 min,用水定容至刻度。移取5 ml该溶液至10 mL, 容量瓶中,用流动相定容,经0.45 m 膜过滤后立即进样。
A.6.5.2 试样溶液的制备
称取约0.035 g试样,精确至 0.000 1 g,置于 100 ml, 容量瓶中,用 90 ml 水溶解。20 ℃ 超声1 min,用水定容至刻度。移取5 ml, 该溶液至 10 ml,容量瓶中,用流动相定容,经 0.45 μm 滤膜过滤后立即进样。
注:溶液均需现配现用,不能长时问存故。
A.6.5.3 测定
在 A.6.4色谱条件下,先注人标准溶液,检查系统适用性。(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸的分离度应不小于2。另取试样溶液,同法测定。(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸标准溶液的參考色谱图见图 C3。(65)-5-甲基四氢叶酸保留时间约为 4.0 min。(6R)-5-甲基四氢叶酸保留时间约为7.4 min。分离度R,按式(A.4)计算:
来源：晓博教育
