摘要：何洁清, 郭聪婷, 李际婷, 等. 利用邻近标记技术检测心肌细胞的分泌蛋白组[J]. 中国心血管杂志, 2025, 30(3): 306-314. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2025.03.012.
中国心血管杂志2025Chinese Journal of Cardiovascular Medicine
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利用邻近标记技术检测心肌细胞的
分泌蛋白组
Detection of cardiomyocyte secretome by using proximity-labeling-based analysis
何洁清 郭聪婷 李际婷 柏宝辰 王泽 郭宇轩 刘健
作者单位：100044 北京大学人民医院心内科(何洁清、柏宝辰、刘健)；100191 北京大学基础医学院、北京大学心血管研究所、血管稳态与重构全国重点实验室(郭聪婷、李际婷、王泽、郭宇轩)
通信单位：郭宇轩，电子信箱：guo@bjmu.edu.cn；刘健，电子信箱：drjianliu@163.com
引用本文：
何洁清, 郭聪婷, 李际婷, 等. 利用邻近标记技术检测心肌细胞的分泌蛋白组[J]. 中国心血管杂志, 2025, 30(3): 306-314. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2025.03.012.
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摘
yao
要
目的
利用邻近标记技术建立检测心肌细胞分泌蛋白组的新方法。
方法
通过分子克隆技术构建质粒，用于表达内质网(ER)定位的TurboID蛋白。在生物素处理的HEK293T细胞中，通过免疫荧光成像和免疫印迹实验(Western blot)对TurboID蛋白的表达、亚细胞定位和邻近标记功能进行验证。在上述质粒基础上包装腺病毒，侵染原代新生大鼠心室肌细胞(NRVM)，加入生物素处理后，使用链霉亲和素磁珠对NRVM培养上清中NRVM细胞分泌的生物素化蛋白进行富集，进行蛋白质质谱分析，检测分泌蛋白组。
结果
在HEK293T细胞和NRVM中，免疫荧光成像结果显示，TurboID蛋白能够定位在细胞核周围对应的ER区域。在添加生物素的作用下，Western blot结果显示，TurboID能将ER蛋白生物素化。用链霉亲和素磁珠对NRVM培养上清中的生物素化蛋白进行富集后，通过蛋白质质谱分析，结果发现心肌细胞的ER、细胞膜和细胞外的蛋白质被显著富集，包括经典的心肌细胞分泌蛋白质心房利尿钠肽。对不含ER-TurboID的NRVM培养上清进行蛋白质组分析，主要获得白蛋白等培养基中的成分，难以检测到心肌细胞的分泌蛋白质。
结论
ER-TurboID技术可有效富集和检测心肌细胞通过ER分泌的蛋白质组，并排除培养基中非细胞来源蛋白的干扰。
心脏的发育、生理和病理过程与心肌细胞的分泌蛋白质密切相关[1]。在基础研究中，由于心肌细胞通过分泌蛋白质与心脏内和心脏外的其他细胞进行密切通讯，研究心肌细胞的分泌蛋白质有助于揭示心脏疾病中的细胞通讯机制和潜在治疗靶点[2]。在临床上，心肌细胞分泌蛋白质的变化与心脏病理变化紧密相关，常用作心脏疾病的生物标志物。例如，心肌细胞分泌的心房利尿钠肽和脑钠肽等蛋白质常被用作心力衰竭严重程度的评价指标[3-4]。心肌细胞分泌蛋白质的检测技术，对于开发新型的、更有效的疾病标志物至关重要。虽然研究心肌细胞的分泌蛋白质具有重要意义，但通过组学技术对这些蛋白质进行系统性分析却十分困难。在实验动物中，经典的心脏组织液和血液的蛋白质组分析，无法有效辨别心肌细胞和其他细胞来源的蛋白质。在体外心肌细胞培养条件下，对培养液中的蛋白质组的分析，则难以区分原培养基中的成分和心肌细胞分泌的成分。因此，对心肌细胞分泌的蛋白质进行特异性标记，从而进行细胞类型特异的分泌蛋白组研究，是关键的研究技术。
邻近标记技术是利用生物素鉴定(biotin identification，BioID)酶或抗坏血酸过氧化物酶2(ascorbate peroxidase 2，APEX2)等非选择性的蛋白质生物素标记酶[5]，对特定靶蛋白或亚细胞空间的邻近蛋白质进行标记的新技术[6-7]。其中，BioID因其反应条件温和、生物相容性好等特点，已在体外细胞培养和体内动物实验中广泛应用，并于近期在心脏基础研究中发挥了重要作用[8]。BioID经历了第一代BioID(又称BirA∗)[9-12]、第二代BioID2[13-14]和第三代TurboID[15]的更新迭代，其标记速率和效率已大幅提高。近期研究证实，TurboID通过遗传修饰可被定位到内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔内，标记细胞通过经典的ER途径分泌的蛋白质[16]。但这种技术是否可应用于心肌细胞的分泌蛋白质研究尚缺乏证据。因此，本研究旨在运用ER定位的TurboID开发心肌细胞的分泌蛋白组研究技术，为心肌细胞的通讯机制和疾病标记物研究提供新方法。1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂
本研究动物实验获北京大学医学部实验动物科研伦理委员会批准(批准号：DLASBD0022)。无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级SD大鼠乳鼠(出生24 h内，雌雄不限)购自北京大学医学部实验动物科学部，动物养护和实验研究严格遵守《实验动物管理与使用指南》。
主要试剂：高糖DMEM(HUANKE，HK2109.17)，链霉素-青霉素混合液(Pricella，PB180120)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(ViscTech，SE100-011)，Hank´s液(Procell，PB180321)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered SAline，PBS)(JSENB，JF7384)，胰蛋白酶(Solarbioc，T8150)，Ⅱ型胶原酶(Worthington biochemical，LS004177)，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，5-BrdU)(Bioss，D50423)，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物(北京擎科生物科技股份有限公司)，Opti-MEM(Gibco，31985070)。本研究中使用的抗体和染料见表1。
表1 抗体和资料
1.2 新生大鼠心室肌细胞分离
新生SD乳鼠用70%乙醇消毒，在无菌条件下剪开胸骨，取出心脏置于冷D-Hank´s溶液中，去除残留的血管和筋膜，反复漂洗去除血液，用眼科剪剪成1.5~2.0 mm3的组织块。组织块转移至无菌玻璃瓶中，加入含有0.1%胰蛋白酶和0.056%Ⅱ型胶原酶的消化液5 ml，置于38.5℃水浴锅中温育消化4 min。取上清液并立即加入5 ml含10�S、1%抗生素的DMEM培养基终止酶反应，1 000 r/min离心5 min，悬浮在含有10�S、1%抗生素的DMEM培养基中，用100 μm筛网过滤掉较大组织块。再采用差速贴壁法去除心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast，CF)，同时加入5-BrdU抑制CF的生长。通过免疫荧光成像对分离得到的新生大鼠心室肌细胞(neonatal rat ventricular myocyte，NRVM)进行鉴定，体外培养48 h后，NRVM可用于后续实验[17]。1.3 流式细胞分析
按前述方法提取NRVM后，1 000 r/min离心5min，然后使用4%多聚甲醛重悬，轻轻上下颠倒混匀，在室温下固定15 min。细胞离心后，弃掉上清，使用PBS重悬，重复此步骤3次。再用0.1%Triton-100/PBS通透，4%牛血清白蛋白/PBS封闭10 min。离心后，用含心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)一抗的封闭液重悬细胞沉淀物，常温孵育30 min(孵育过程中每5 min颠倒混匀1次)。离心，弃掉上清，PBS重悬，重复此步骤3次。之后，将细胞与荧光二抗在常温环境下避光孵育30 min。离心样本，弃掉上清，PBS重悬，重复此步骤3次。最后用1 ml PBS重悬，并上样到BD FACSymphonyTMA1流式细胞仪中，分析样本。1.4 ER-TurboID 质粒构建和病毒包装
SP-HA-TurboID-KDEL编码序列从Addgene[16]中获得，使用分子克隆技术将其克隆至我们实验室已有载体pAAV-CMV-GFP-NEXN[8]，生成pAAV-CMV-SP-HA-TurboID-KDEL质粒，再将其克隆至pADV-CMV-MCS-ZsGreen1载体中，生成pADV-CMV-SP-HA-TurboID-KDEL质粒。pADV-CMV-MCS-ZsGreen1载体从武汉淼灵生物科技有限公司购入。在对pADV-CMV-SP-HA-TurboID-KDEL质粒功能进行验证后，我们将其交由和元生物技术股份有限公司包装为腺病毒。1.5 细胞培养与转染
使用构建成功的ER-TurboID质粒，并使用Lipo8000转染试剂(Beyotime，C0533)对HEK293T细胞进行转染[18]，同时在培养基中添加外源生物素(50 μM)。具体实验流程如下：在转染前1 d，按照每孔50万HEK293T细胞接种到24孔板内进行培养。第2天，开始转染前细胞密度达到约80%。此时把培养有细胞的24孔板每孔换成500 μl生物素浓度为50 μM的新鲜培养基(含有10%血清和1%抗生素的完全DMEM培养基)。取一个洁净无菌离心管，对于待转染的 24孔板中每一个孔的细胞，加入25 μl Opti-MEM、500 ng质粒DNA和0.8 μl Lipo8000转染试剂，混匀。按照每孔用量25 μl，均匀滴加Lipo8000转染试剂和质粒DNA的混合物到24孔板内，混匀。持续培养24 h后，用免疫荧光成像和免疫印迹(Western blot)实验检测转染效果。
使用ER-TurboID质粒包装的腺病毒对NRVM细胞进行转染，并在培养基中添加外源生物素(50 μM)，同时加入聚凝胺(Yeasen，40804ES76)辅助转染过程[19]。具体实验流程如下：在转染前2 d，从新生SD乳鼠体内提取NRVM，按照每孔50万细胞接种到24孔板内进行培养。使用含有1%5-BrdU的新鲜培养基(含有10%血清和1%抗生素的完全DMEM培养基)培养NRVM 48 h，以抑制CF生长。开始转染前，取一个洁净无菌离心管，对于待转染的24孔板中每一个孔的细胞，加入500 μl生物素浓度为50 μM的新鲜培养基(含有10%血清和1%抗生素的完全DMEM培养基)，再加入感染复数(MOI)=20的对应量病毒，以及0.5 μl聚凝胺，混匀。按照每孔用量500 μl，将培养有NRVM的24孔板每孔更换为前述病毒转染液。转染12 h后，弃去病毒转染液，更换为500 μl生物素浓度为50 μM的新鲜培养基(含有10%血清和1%抗生素的完全DMEM培养基)。再持续培养24 h后，用免疫荧光和Western blot检测转染效果。
1.6 免疫荧光成像
用4%多聚甲醛固定贴壁的 HEK293T细胞、HeLa细胞[20]或NRVM，再用0.1%Triton-100/PBS通透，4%牛血清白蛋白/PBS阻断。然后用相应一抗孵育细胞，并在4℃环境下过夜。隔日，将细胞与荧光二抗在常温环境下避光孵育2 h。在成像前，我们用抗荧光淬灭剂(Invitrogen，36961)对染色完成的细胞爬片进行封片。使用徕卡STELLARIS 8倒置、FLIM连续双光谱高分辨率共聚焦显微镜，40×2.0物镜拍摄共聚焦图像。1.7 Western blot检测
用添加有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液对贴壁的HEK293T细胞或NRVM进行裂解。取细胞裂解液与2×SDS样品缓冲液1∶1混合，并以70℃金属浴加热10 min使蛋白变性。之后，用4%~12%Bis-Tris梯度凝胶(GenScriptSurePAGE，M00654)分离，并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(Thermo Scientific，88518)上，用4%牛奶/TBST封闭。将相应一抗与PVDF膜在4℃环境下孵育过夜后，使用HRP标记的二抗在常温下孵育PVDF膜1~2 h，再使用iBrightTMCL150仪器进行化学发光检测。1.8 生物素化蛋白富集和质谱分析
使用与前述NRVM转染过程相同配比的ER-TurboID腺病毒转染液，对10 cm皿内的NRVM转染12 h，弃去转染液并更换为含生物素的新鲜培养基培养24 h，之后收集NRVM的培养基。使用3kDa规格的超滤管(Millipore，UFC9003)对收集到的约10 ml NRVM培养基进行超滤浓缩，离心速度为4 000 r/min。在超滤离心过程中，加入PBS对培养基反复洗涤6次，以去除培养基中游离的生物素，最后统一定容至1 ml。对每个样品，取400 μl链霉亲和素包被的磁珠(Beaverbio，22306)，除去上清后，用RIPA-High缓冲液[50 mM Tris-HCl pH8.0，500 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1% TritonX-100，1%脱氧胆酸钠，0.2% SDS]清洗2次，弃上清，与超滤浓缩后的1 ml液体混合，并置于旋转混合仪上4℃环境孵育过夜。隔日对磁珠进行如下处理：SDS缓冲液(2%SDS)清洗2次，高盐缓冲液[50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) pH7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠]清洗2次，氯化锂缓冲液(50 mM Tris-HCl pH8.0，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.5%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠)清洗2次，50 mM NH4HCO3缓冲液清洗4次[8]。处理后的磁珠保持干燥状态，经干冰运输，交由上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析。质谱分析过程如下：每份磁珠样本中加入 SDT缓冲液(4%SDS，100 mM Tris-HCl，pH7.6)对蛋白进行洗脱，之后以处理30 s、间歇30 s的规律进行超声处理，总工作时长为40 min。然后95℃水浴8 min，25℃ 20 000 r/min离心20 min。再在每份样品中分别加入二硫苏糖醇(DTT)(161-0404，Bio-Rad)(终浓度为40 mM)，以600 r/min混合1.5 h(37℃)。样品冷却至室温后，在混合物中加入终浓度为20 mM的碘乙酰胺(163-2109，Bio-Rad)，避光孵育30 min。接下来，将样品转移到过滤器(Millipore，MRCPRT010)中。过滤器用100 μl尿素缓冲液(8M尿素，150 mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤3次，然后用100 μl 25 mM NH4HCO3缓冲液洗涤2次。最后，在样品中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质的质量百分比为1∶50)，37℃孵育15~18 h(过夜)，收集得到含肽滤液。每个样品的多肽在C18墨盒(EmporeTM SPE Cartridges MCX，30 UM，水)上脱盐，真空离心浓缩，并在40 μl的0.1%(体积百分比)甲酸中重组，测定280 nm处的紫外光光谱密度以对肽定量。在数据非依赖采集(data independent acquisition，DIA)实验中，加入索引保留时间(indexed retention time，iRT)，通过OrbitrapcTM AstralTM质谱仪(Thermo Scientific) DIA与数据依赖的Neo系统液相色谱(Thermo Scientific)模式对样品中的肽进行分析。DIA数据采用DIA-NN 1.8.1进行分析，所得数据均基于99%的蛋白质鉴定置信区间，由假发现率(FDR)≤1%确定。
1.9 质谱结果数据分析
使用National Institutes of Health DAVID Bioinformatics网站进行生物学数据分析[21]。在DAVID中，通过以下步骤进行功能注释和富集分析。(1)数据输入：将质谱分析得到的差异表达蛋白或肽段列表(如基因名称或UniProtID)上传至DAVID工具。(2)功能注释：在DAVID中，使用“Functional Annotation Tool”对输入基因列表进行功能注释，包括GO分析等。(3)使用“Functional Annotation Clustering”模块对注释结果进行聚类分析，计算每个功能类别或通路的富集显著性(P值)。P值通过超几何分布检验(Fisher精确检验)计算，以评估目标基因列表在特定功能类别中的富集程度。通常P2 结果
2.1 在HEK293T细胞和HeLa细胞中验证ER-TurboID质粒
我们将TurboID蛋白的N端连接ER信号肽，C端连接ER滞留信号“赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸”序列(Lys-Asp-Glu-Leu， KDEL)，从而将TurboID蛋白定位在ER腔中，称作ER-TurboID。原理上，ER-TurboID 在添加外源生物素的情况下，预期可以非选择性地生物素化 ER 中的蛋白，包括通过ER经典分泌途径分泌的蛋白质[22]，从而实现对分泌蛋白质的标记，见图1A。首先通过分子克隆构建了表达ER-TurboID的质粒，具体质粒图谱见图1B。质粒测序验证后，使用该质粒对HEK293T细胞进行转染，同时添加外源生物素培养，并取细胞裂解液进行Western blot实验。通过对HA标签的检测，我们证实了ER-TurboID在细胞中成功表达。用HRP标记的链霉亲和素检测蛋白的生物素化，发现与未经生物素处理的对照组相比，生物素处理的HEK293T细胞含有丰富的生物素化蛋白条带，见图1C。
免疫荧光成像结果显示，在转染ER-TurboID质粒的细胞中，HA标签标记的TurboID蛋白定位在细胞核周围，并在细胞质内呈现网状结构，符合ER的定位核形态。与无生物素处理的对照组相比，生物素处理的HEK293T细胞中，可见链霉亲和素标记的生物素化蛋白与含有HA标签的TurboID蛋白形成共定位，见图1D。由于相对于HEK293T细胞，HeLa细胞具有细胞形态更加扁平、核膜与ER结构更加舒展以及便于观察的特点，我们使用HeLa细胞进一步验证ER-TurboID的亚细胞定位和功能。免疫荧光结果显示，HA标签标记的TurboID蛋白及其生物素标记的其他蛋白，均呈现明显的ER形态，见图1E。这些结果显示，ER-TurboID质粒可在HEK293T细胞和HeLa细胞中通过生物素处理特异性地标记ER中的蛋白。
注：ER，内质网；AMPr，抗氨苄青霉素；ori，复制起始位点；5’ITR，5’末端反向重复序列；CMV，CMV启动子；SP，信号肽；HA，血凝素；KDEL，赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸序列；3’ITR，3’末端反向重复序列；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；SA，链霉亲和素；A.经典分泌蛋白质的胞内分泌途径；B.ER-TurboID质粒及其主要作用元件；C.ER-TurboID质粒转染HEK293T细胞后，取细胞裂解液进行Western blot检测；D. ER-TurboID质粒转染HEK293T细胞后，进行免疫荧光染色；E.ER-TurboID质粒转染HeLa细胞后，进行免疫荧光染色
图1 ER-TurboID质粒构建并在HEK293T细胞和HeLa细胞内验证
2.2 在NRVM中验证表达ER-TurboID的腺病毒
接下来，我们从乳鼠心脏中分离培养NRVM，用免疫荧光法对NRVM的标记物进行鉴定，见图2A。同时，使用流式细胞分析法对NRVM中心肌细胞的纯度进行定量，可见NRVM细胞纯度约为85%，见图2B。之后，包装了表达ER-TurboID的腺病毒，对NRVM转染12 h后，添加生物素(50 μM)处理24 h。Western blot实验结果显示，腺病毒能够在NRVM中表达HA标记的ER-TurboID蛋白。在腺病毒和生物素共同处理下，能够观察到大量生物素化的蛋白，见图2C。
免疫荧光成像能够在 NRVM 中检测到ER-TurboID蛋白，见图2D。ER-TurboID在细胞核周的分布以及细胞质中呈现的网状形态，确认其正确定位在ER。在生物素处理组，链霉亲和素标记的生物素化蛋白与含有HA标签的TurboID蛋白形成较强的共定位，证实腺病毒表达的ER-TurboID能够在NRVM中标记ER中的蛋白质。
注：ER，内质网；NRVM，新生大鼠心室肌细胞；cTnT，心肌肌钙蛋白T；ACTN2，α-辅肌动蛋白2；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚；Alexa Fluor488：免疫荧光二抗；HA，血凝素；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；SA，链霉亲和素；A.免疫荧光法鉴定cTnT和ACTN2在NRVM中的表达；B.流式细胞分析法鉴定NRVM中cTnT阳性细胞占比；C.ER-TurboID腺病毒转染NRVM后，取细胞裂解液进行Western blot检测；D.ER-TurboID腺病毒转染NRVM后，进行免疫荧光染色
图2 ER-TurboID腺病毒在NRVM内验证
2.3 ER-TurboID法结合质谱分析检测心肌细胞的分泌蛋白质
接下来，我们取 NRVM 的培养上清，与链霉亲和素磁珠共孵育，从而富集ER-TurboID标记的分泌蛋白质，并采用蛋白质质谱方法进行鉴定，实验流程见图3A。质谱检测到的蛋白质的基因本体-细胞组分(Gene Ontology-Cellular Component)分析显示，该实验检测到的蛋白主要为细胞外蛋白，见图3B。富集蛋白量排名前20的蛋白包括了经典的心肌细胞分泌蛋白质心房利尿钠肽(NPPA编码)，进一步确定了ER-TurboID技术检测心肌细胞分泌蛋白质的有效性。
在ER-TurboID检测到的蛋白中，我们还发现了心肌细胞的ER蛋白钙腔蛋白(calumenin，CALU)[23]以及经典的通过ER加工的心肌细胞胞膜蛋白神经钙黏蛋白(N-cadherin，CDH2)[24-25]，提示心肌细胞ER中的其他蛋白质也有可能释放到培养基中。除此以外，也观察到大量细胞外基质蛋白的富集，提示ER-TurboID可能也标记了NRVM中掺杂的成纤维细胞，见图3C。注：ER，内质网；NRVM，新生大鼠心室肌细胞；A.ER-TurboID腺病毒转染NRVM，磁珠富集蛋白并质谱分析流程；B.基因本体-细胞组分，P表示修正后的Fisher精确检验的P值；C.对TurboID法富集蛋白质谱分析定量前20名
图3 基于ER-TurboID腺病毒转染的NRVM分泌蛋白质分析
2.4 ER-TurboID法相对于直接质谱法的技术优势分析
接下来，我们取未经ER-TurboID处理的NRVM培养基上清液，采用相同的技术方法进行蛋白质组分析，并与ER-TurboID法得到的数据进行对比。韦恩图显示，相较于培养基上清液的直接质谱分析，ER-TurboID法检测到的蛋白质种类更多。两种方法检测到的蛋白仅有31%的交集，见图4A。直接质谱法富集蛋白量排名前10的蛋白包括了含量极丰富的白蛋白(albumin，ALB)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ)、维生素D-结合蛋白(vitamin D-binding proteins，DBP)、α2-HS-糖蛋白(α2-HS-glycoprotein，AHSG)等，均为NRVM培养基中FBS的成分，见图4B。由此可见，ER-TurboID法可有效排除培养基成分对分泌蛋白组研究的严重干扰，更加灵敏准确地检测心肌细胞的分泌蛋白质。
注：NRVM，新生大鼠心室肌细胞；ER，内质网；A.直接对NRVM培养基上清进行质谱分析和TurboID法质谱分析结果，二者共有蛋白的韦恩图；B.直接对培养基质谱分析富集蛋白定量前10名
图4 NRVM培养基上清质谱分析与ER-TurboID质谱分析结果对比
3 讨论
研究心肌细胞的分泌蛋白质，对于理解心脏正常功能的调节机制、揭示心脏疾病的发生发展机制以及开发新的心血管疾病生物标记物和治疗靶点[26]具有重要意义。传统的体外心肌细胞分泌蛋白质研究直接对培养基上清进行质谱分析，这种方法检测到的蛋白种类较少。由于培养基中本身就含有多种蛋白质，如血清中的白蛋白[27]、抗凝血酶等，其丰度远高于心肌细胞的分泌蛋白质，所以通过传统研究方法检测到的心肌细胞分泌蛋白质，其种类和数量会在很大程度上受到培养基成分的干扰。如在检测过程中选择使用无血清、无动物源成分的培养基，一方面其中仍然含有其他非细胞来源的蛋白成分且这种培养基价格昂贵，另外一方面这会影响细胞的分泌状态[2]，进而可能改变检测结果。在本研究中，为了解决传统研究方法的技术缺陷，我们建立了ER-TurboID技术检测心肌细胞的分泌蛋白质。这种新技术通过将TurboID特异性地定位到ER中，可以标记通过ER途径分泌的蛋白。相较于培养基上清液的直接质谱分析，ER-TurboID法检测到的蛋白种类更多，且降低了培养基等其他来源蛋白的干扰。因此，ER-TurboID能够更加灵敏、高效地描绘心肌细胞分泌图谱，有望在心脏疾病的病理机制和生物标记物研究中发挥重要作用。除了经典的ER途径外，心肌细胞还可通过细胞外囊泡、细胞膜转运、细胞膜破裂等方式释放蛋白质，经典的例子包括心肌损伤标记物肌钙蛋白等[28]。目前，ER-TurboID法还不能富集到这部分蛋白质，但未来TurboID技术也可能被定位到细胞质中，从而检测这些通过非经典途径产生的心肌细胞分泌蛋白质。
本研究除了心肌细胞的分泌蛋白质外，还检测到了细胞外基质等非心肌细胞的分泌物。这可能是由于NRVM提取流程存在固有缺陷，即使通过细胞差速贴壁、BrdU处理等方法尽量提高其纯度，NRVM中仍然不可避免地掺杂一些其他细胞类型，特别是成纤维细胞。潜在的解决方案包括利用心肌细胞特异性启动子驱动ER-TurboID在心肌细胞中特异性表达[8]，同时在提取过程中通过细胞分选等技术尽可能提高NRVM的纯度，从而降低其他细胞类型来源的分泌蛋白质干扰。
本研究中检测的是正常培养条件下心肌细胞的分泌蛋白质。在此基础上，后续研究可在各种心脏疾病的细胞模型中应用ER-TurboID。例如，本研究成果可应用于心肌损伤、心肌肥厚、遗传突变等各种细胞模型中，研究病理因素如何改变心肌细胞的分泌蛋白质。ER-TurboID也可被包装到AAV等适合在动物体内靶向心肌细胞的载体中[8，10]，通过尾静脉注射等方式实现TurboID在动物细胞内的表达，从而在体内环境中研究心肌细胞的分泌蛋白质。因此，本研究成果具有明显的实用价值，是推动心血管研究发展的重要新工具。来源：中国心血管杂志
