Nat Biotechnol | AI辅助微同源模板设计，助力外源基因精准定向整合

摘要：D NA 定向精准整合在生物工程及基因治疗领域具有重要价值【1】。传统上，该过程依赖于D NA 双链断裂（D SB s）及后续的同源重组修复（H DR ），因此须使用长片段同源臂，且该策略仅适用于增殖期细胞。C RISPR - C as基因编辑技术的发展显著提

撰文 |木兰之枻

D NA 定向精准整合在生物工程及基因治疗领域具有重要价值【1】。传统上，该过程依赖于D NA 双链断裂（D SB s）及后续的同源重组修复（H DR ），因此须使用长片段同源臂，且该策略仅适用于增殖期细胞。C RISPR - C as基因编辑技术的发展显著提高了H DR 介导的定向精准整合效率，并拓展了通过非同源末端连接（N HEJ ）、微同源末端连接（M MEJ ）及单链退火等机制实现精准定向整合的新途径【2】。然而，现有基于N HEJ 及M MEJ 的策略常会引起整合位点周边序列的缺失，可能对邻近基因功能造成不利影响【3-5】。

在细胞内D SB s修复机制中，M MEJ 途径通常产生具有特定局部序列特征的微缺失突变，其缺失区域往往涉及三个相邻碱基对。这种微缺失突变通常可保持编码框不发生移码，这在生物技术应用中具有独特优势。近年研究表明，CRISPR-Cas系统诱导DSBs后同样可激活MMEJ通路，且该机制在植物、斑马鱼、非洲爪蟾以及人类等多种物种中高度保守。其修复产物具有可预测的序列模式，能够通过诸如inDelphi等深度学习模型对修复结果进行准确预测，因此在人工智能辅助下可用于实现特定序列的精准删除【6】。此外，MMEJ已被尝试用于外源基因的定向整合，但其介导整合后邻近区域的序列特征是否能够通过深度学习模型有效预测，目前尚不明确。

近日，来自瑞士苏黎世大学的 Soeren S. Lienkamp 实验室与比利时根特大学的 Thomas Naert 合作在 N ature B iotechnology 发表题为 Precise, predictable genome integrations by deep-learning-assisted design of microhomology-based templates 的论文。文章指出，外源基因在基因组中进行定向整合时，其整合区域的修复特征能够通过深度学习模型实现有效预测。研究者开发出一种新的AI辅助设计工具Pythia，并在此指导下设计出一种具有碱基对串联重复结构的修复臂，能够在确保阅读框稳定的前提下实现D NA 精准整合。在包括人源细胞系、非洲爪蟾及成年小鼠大脑在内的多种模型系统中的实验证实，该策略可成功实现从增殖细胞到非分裂神经元等多种细胞类型中的精确基因整合。

研究者证实，C RISPR-Cas 系统诱导产生的D SB s所引发的内源性修复结果并非随机发生，而是可根据局部序列特征进行预测。为此研究者利用已有算法in D elphi对定向整合后DSBs断裂末端与外源供体DNA连接处的编辑结果进行了预测分析。 I n D elphi预测显示，连接处的内源修复主要导致4bp碱基缺失。随后研究者通过对外源供体D NA 两侧的微同源序列进行优化设计，发现在切口右侧增加3bp的微同源序列后，主要修复结果从原先的4bp缺失转变为3bp缺失；如果进一步增加串联重复的3bp微同源序列，可进一步提升修复结果中包含3bp微同源序列的比例。随后研究者还在基因组 A AVS1 “安全港”位点开展实验，证实微同源串联修复臂 (µH tandem repeat repair arms) 介导的D NA 定向整合不仅效率高，还能有效避免阅读框移码，且整合位点的修复结果与in D elphi的预测高度一致。以上结果表明，带有微同源串联修复臂的外源供体D NA 可有效调控定向整合位点的修复方式。

研究者还对基于微同源串联修复臂的DNA定向整合与NHEJ介导的D NA 定向整合效果进行了比较，发现微同源串联修复臂能够有效维持基因组的完整性，并减少整合位点处的碱基缺失。研究进一步表明，局部序列特征对整合效率影响显著，研究者据此提出了优化微同源串联修复臂介导D NA 定向整合的gRNA筛选标准：（1）第-4位为G碱基；（2）in D elphi预测出现+1碱基插入的概率低于25%；（3）in D elphi预测中，使用微同源串联修复臂的编辑结果占比要高。上述结果说明，基于深度学习的预测分析能够有效提升整合结果的质量，并为理性设计更高效的整合策略提供重要依据。随后研究者还证实，基于微同源串联修复臂的DNA定向整合可在爪蟾胚胎和小鼠大脑中实现多种供体模板的单拷贝整合以及内源蛋白的标记。

在上述研究的基础上，，研究者进一步开发了一种新型预测算法Pythia （ https://www.pythia-editing.org/ ），能够有效预测通过CRISPR介导的单链模板修复（SSTR）技术实现目标位点单碱基替换的效率。基于该算法，研究者可理性设计小型ssODN修复模板，并在爪蟾胚胎中成功实现了单碱基对的精准替换。

本研究证实，在CRISPR-Cas9介导的DNA双链断裂与外源供体DNA的连接位点， DNA修复结果具备高度可预测性。基于这一发现，研究者设计开发出新的AI辅助模型Pythia，能够有效筛选出可驱动高效整合的gRNA，进而理性设计出靶向特异性修复模板以提升靶位点修复效率。该研究不仅深化了我们对CRISPR介导的DNA修复机制的理解，也为相关基因编辑工具的优化与应用提供了重要支持。

制版人：十一

参考文献

1. Wang, J. Y. & Doudna, J. A. CRISPR technology: a decade of genome editing is only the beginning.Science379, eadd8643 (2023).

2. Silva, J. Fda, Meyenberg, M. & Loizou, J. I. Tissue specificity of DNA repair: the CRISPR compass.Trends Genet.37, 958–962 (2021).

3. Adikusuma, F. et al. Large deletions induced by Cas9 cleavage.Nature560, E8–E9 (2018).

4. Park, S. H. et al. Comprehensive analysis and accurate quantification of unintended large gene modifications induced by CRISPR–Cas9 gene editing.Sci. Adv.8, eabo7676 (2022).

5. Boutin, J. et al. CRISPR–Cas9 globin editing can induce megabase-scale copy-neutral losses of heterozygosity in hematopoietic cells.Nat. Commun. 12, 4922 (2021).

6. Shen, M. W. et al. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants.Nature563, 646–651 (2018).

学术合作组织

（*排名不分先后）